10 313例新生儿听力与耳聋易感基因联合筛查结果分析*

李茜，王诺扬，童鸣，陈灿明，曹伟，胡苏玮，刘琍（扬州大学医学院附属医院扬州市妇幼保健院 .医学遗传中心，.五官科，江苏扬州 225002）

听力障碍是我国常见的出生缺陷疾病之一，严重影响患儿的语言及认知发育。据统计，听力障碍发病率约为1‰～3‰［1］，其中约50%～60%病因与遗传因素密切相关［2］。随着新生儿听力筛查在临床上的广泛开展，越来越多先天性耳聋的患儿得到了及时的诊断与干预。但与此同时，笔者也发现，新生儿听力筛查难以及时发现导致可能患有迟发性听力损失的新生儿及携带药物致聋敏感基因的新生儿。因此，对新生儿进行听力和耳聋易感基因联合检测可以弥补新生儿听力筛查的不足，同时降低先天性耳聋的漏检率。本研究对扬州地区10 313例新生儿进行听力与耳聋易感基因联合筛查，并对检测结果进行分析，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2018年3月至2020年12月在扬州市妇幼保健院出生并接受听力与耳聋易感基因联合筛查的活产新生儿共计10 313例，其中男婴5 384例，女婴4 929 例，于出生后72 h 进行研究。本研究通过扬州市妇幼保健院伦理委员会审核批准（No.2020019），所有受检新生儿的家长均被详细告知听力筛查及耳聋易感基因检测的相关知识，充分理解同意后填写知情同意书。

1.2 主要仪器及试剂 TC-96／G／H（b）C 基因扩增仪（杭州博日科技公司），HB-2012A 导流杂交仪（广东凯普生物科技公司），3500Dx基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）。离心柱法核酸提取试剂及耳聋易感基因检测试剂盒（广东凯普生物科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 耳聋易感基因检测 新生儿出生72 h 时采集足跟血3～5滴，制成每个血斑直径8 mm的血斑卡，待其自然风干形成干血片后，参照离心柱法核酸提取试剂的标准操作程序提取基因组DNA，采用耳聋易感基因检测试剂盒对4个耳聋基因的13 个位点，包 括 GJB2 基因 （c.35delG，c.176del16，c.235delC，c.299delAT，c.155delTCTG），SLC26A4 基因（c.2168A＞G，c.919-2A＞G，c.1229C＞T），GJB3 基因（c.538C ＞T），线粒体 12SrRNA （m.1555A ＞G，m.1494C＞T）和 线 粒 体 tRNA （m.7445A ＞ G，m.12201T＞C）进行检测。耳聋基因检测过程中PCR扩增、杂交、显色等步骤均依照检测试剂盒及相关仪器使用说明书进行。

1.3.2 耳聋易感基因测序 采用 Sanger 测序技术对单个位点杂合突变的听力损失患儿进行耳聋相关基因测序验证。使用 PCR 反应对 SLC26A4、GJB2、GJB3 及 mtDNA 基因的 43 个目标位点进行扩增，并采用特异性引物进行Sanger测序检测。特异性引物的设计是专门针对目标位点，并覆盖该位点上、下游的序列。标本检测得到的序列与NCBI提供的 SLC26A4 基因参考序列（NG＿008489.1）／（NM ＿000441.1）、GJB2 基因参考序列（NM＿004004.5）、GJB3 基因参考序列（NM＿001005752.1）及mtDNA 基因参考序列（NC＿01292）进行比对和注释。突变的表述参照Human Genome Variation Society（HGVS）version 15.11 进行。

1.3.3 听力筛查评估及诊断 正常新生儿于出生48～72 h时采用耳声发射法（oto-acoustic emission，OAE）进行初次听力筛查；危重新生儿出生于48 h后采用自动听性脑干反应（automatic auditory brainstem response，AABR）进行听力筛查。初筛不通过者1个月后进行复筛，复筛采用OAE 与AABR 联合检测。复筛未通过者，于3月龄采用听性脑干诱发电位法（auditory brainstem response，ABR）进行听力诊断。ABR 为正负交替极性刺激的click 音，极间电阻＜2 kΩ，叠加次数2 006 次。将电极置于前额正中发际处，双侧乳突为参考电极，鼻根部为地极。选择起始刺激强度，以10 dB 递降，至V 波消失时上升5 dB 刺激观察V波以获得反应阈。V波反应阈（正常听力级，下同）≦30 dBnHL为正常；以V波反应阈＞30 dBnHL作为听力损失指标，分为轻度（31～50 dBnHL）、中度（51 ～70 dBnHL）、重度（71～90 dBnHL）以及极重度（＞91 dBnHL）［3］。

1.4 统计学分析 应用 SPSS 15.0 统计软件进行数据分析，计数资料用 χ2检验，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耳聋易感基因检测结果 10 313 例新生儿共检出耳聋基因突变577 例，检出率为5.59%。4 种基因单个位点突变携带者共565 例，检出率约为5.48%，其中 GJB2 基因突变携带率约为 3.03%，SLC264A基因突变携带率约为1.89%，GJB3基因突变携带率约为0.24%，线粒体DNA 突变携带率约为0.32%（表1）。除此之外，另有复合杂合突变／双基因杂合突变12例，携带率约为0.12%。

表1 10 313例新生儿耳聋易感基因单个位点突变携带率

2.2 听力筛查及评估结果 10 313 例新生儿中，有8 999例（87.26%）通过了听力初筛。968 例进行了复筛，790例（81.61%）通过了复筛。经听力学评估最终确诊为听力损失者38 例，听力障碍发生率为 0.37%。

2.3 新生儿听力与耳聋易感基因联合筛查结果10 313 例新生儿中，耳聋易感基因筛查阳性577例，经听力筛查初筛及复筛，最终确诊听力损失16例，听力障碍发生率为2.77%。耳聋易感基因筛查未见异常9 736例，经听力初筛和复筛最终确诊听力损失22 例，听力障碍发生率为0.23%。二者差异有统计学意义（χ2＝ 96.257，P＜0.01）。577 例基因筛查阳性新生儿中，565 例为单个位点突变，12例为复合杂合突变／双基因杂合突变，各基因突变频率及听力损失情况见表2、表3。

表2 565例单个位点突变频率及听力损失情况

表3 GJB2或SLC26A4基因纯合／复合杂合／双基因杂合突变者听力诊断及干预的情况

2.4 3例听力重度受损患儿的家系分析结果 家系1：先证者出生时双耳听力筛查通过，父母听力正常。耳聋易感基因检测提示 SLC26A4 基因c.919-2A＞G杂合突变。至3 周岁时患儿出现呼之不应，反应迟钝等症状，诊断为双耳听力极重度损失。对先证者行耳聋易感基因GJB2、SLC26A443、GJB3及线粒体基因43 位点全测序，发现该患儿为SLC26A4 基因 c.919-2A＞G／c.1988G＞A 复合杂合突变（图1A），结合患儿“双侧前庭导水管水肿”的临床表型，建议听力正常的父母行SLC26A4基因Sanger测序验证，经检测发现 SLC26A4 c.919-2A＞G 杂合变异遗传自母亲，SLC26A4 c.1988G＞A杂合变异遗传自父亲。

家系2：先证者出生时双耳听力筛查通过，耳聋易感基因检测提示SLC26A4基因c.919-2A＞G杂合突变。至4周岁时患儿出现听力衰减，口齿不清等症状，颞骨CT 螺旋扫描提示双侧前庭导水管呈喇叭口样扩张。结合患儿的临床表型，建议患儿及听力正常的父母行SLC26A4 基因测序家系验证，经Sanger测序发现患儿为SLC26A4基因c.919-2A＞G／c.2086C＞T 复合杂合突变（图 1B），其中 c.919-2A＞G杂合变异遗传自母亲，c.2086C＞T 杂合变异遗传自父亲。

家系3：先证者出生时双耳听力初筛及复筛均未通过，耳聋易感基因检测提示为SLC26A4 基因c.919-2A＞G杂合突变。至2 月龄时患儿出现呼之不应，反应迟钝等症状，听力诊断为双耳听力重度损失。先证者母亲为耳聋患者，对其行耳聋易感基因检测，提示先证者母亲存在 SLC26A4 基因c.919-2A＞G杂合突变。结合家系信息，建议先证者及其母亲行SLC26A4基因Sanger测序，发现该患儿及母亲均为SLC26A4基因c.919-2A＞G单个位点杂合突变（图1C）。

图1 各家系Sanger测序结果

3 讨论

国内多项耳聋分子流行病学研究显示，GJB2、SLC26A4、GJB3及12SrRNA是遗传性耳聋最常见的4个致病基因［4-5］。本研究共完成扬州地区新生儿检测10 313例，检出577 例携带致病突变，突变率约为 5.59%，该数据低于承德地区［6］的研究结果（10.66%），但高于武汉［7］和东莞地区［8］的耳聋突变检出率（3.00% ～3.53%），与西北地区［9］的耳聋突变检出率相近（5.18%）。本研究中4 个基因突变检出率由高到低依次为GJB2（3.03%）、SLC26A4（1.89%）、线 粒 体 12SrRNA （0.30%）和 GJB3（0.24%），与文献数据相似［10-11］，位点突变频率前 5位 依 次 为 GJB2 c.235delC （2.34%）、SLC26A4 c.919-2A＞G（1.47%）、GJB2 c.299 del AT（0.48%）、SLC26A4 c.2168A＞G（0.36%）及 12SrRNA m.1555A＞G（0.28%），与其他地区研究结果不尽相同［12，15］。本研究检出 GJB2 c.235delC 突变携带率约为2.34%，高于绍兴、昆明等地区文献报道的携带率［13-14］，提示扬州地区耳聋易感基因以 GJB2 c.235delC为主要突变热点。SLC26A4 c.919-2A＞G为本地区另一主要突变热点，本研究检出195 例该位点突变，携带率为 1.47%，略低于辽宁［15］、淄博［16］等地区，但高于成都［17］、杭州［11］等地区。以上研究结果证实了我国耳聋易感基因突变频率存在地域差异［18-20］，因此，了解本地区耳聋易感基因的突变频率，有助于未来更准确地实现本地区耳聋出生缺陷防控。

本研究中577 例耳聋易感基因突变携带者的听力障碍发生率为2.77%，高于9 736 例耳聋易感基因筛查阴性者的听力障碍发生率（0.23%），可知耳聋易感基因突变携带者中更易出现听力损失。目前已知GJB2基因及SLC26A4基因突变以常染色体隐性遗传为主，纯合或复合杂合突变可导致听力损失，本研究检出2 例GJB2 c.235del 纯合突变携带者出现重度听力损失，4 例 SLC26A4 c.919-2A＞G纯合突变携带者中有2例表现出极重度听力损失，此外，5 例GJB2 基因或SLC26A4 基因的复合杂合突变携带者也出现听力损失，并且听力损失程度与基因纯合突变的听力损失程度相差无几，证明基因复合杂合突变与纯合突变具有同等效力，这与文献报道的研究结果基本一致［21-22］。值得注意的是，携带SLC26A4 c.919-2A＞G纯合突变或复合杂合突变的耳聋患者均表现为极重度听力损失，这提示我们SLC26A4 c.919-2A＞G 突变导致的耳聋症状较其他基因突变可能更为严重。由于SLC26A4 基因突变携带者在生长发育过程中，可因外在因素造成进行性听力损失，因而，本研究对2 例暂未出现听力损失的SLC26A4纯合突变患儿发放生活指导卡片，并叮嘱家长在日常生活中注意避免如感冒、发热、颅外伤或颅压增高等突发损失，随时关注幼儿听力变化。本研究中线粒体突变频率位列第三，且以12SrRNA m.1555A＞G突变为主，与已报道的研究结论相近［23-24］。线粒体突变为母系遗传，其子代均为突变基因携带者，线粒体12SrRNA突变与氨基糖苷类抗生素（aminoglycoside antibiotic，AmAn）的应用密切相关，使用氨基糖苷类抗生素可导致不可逆的听力损失。当发现新生儿为线粒体突变携带者，则向其家长发放氨基糖苷类药物警示卡，并告知父母提高对氨基糖苷类药物或其他耳毒性药物的警惕，谨慎用药，最大程度避免其成长过程中因使用氨基糖苷类抗生素导致的听力损失。截至目前，本研究线粒体突变携带者的后续随访听力均未见异常。另外，本研究25例GJB3基因杂合突变携带者亦未见听力损失。但GJB3基因突变可引起常染色体隐性或显性遗传的后天高频感音神经性耳聋［25］，因此对携带GJB3基因突变的新生儿可长期随访其听力情况。

本研究对3例SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变的耳聋患儿进行了家系检测。确认了其中2 例患儿的病因是携带SLC26A4基因的复合杂合突变，再次支持了SLC26A4基因隐性遗传的致病证据，也提示了孕前夫妻双方进行耳聋易感基因检测的必要性。此外，尚有 1 例患儿经 Sanger 测序确认为SLC26A4基因的单个位点杂合突变的携带者，且遗传自同样听力损失的母亲。笔者推测该患儿的致聋病因有以下可能：一是SLC26A4基因存在不完全外显；二是存在其他罕见的耳聋基因的突变。面对此种情况，耳聋基因靶向测序或全外显子测序似乎是更适合的检测方式。

本研究听力筛查与耳聋易感基因筛查联合开展，互为支持，互为补充，但依然存在一些不足之处。例如，由于人们对耳聋及耳聋易感基因认知和接受程度不同，本研究2例GJB2 c.235delC杂合突变听障患儿、1 例 GJB2 c.299delAT 杂合突变听障患儿及1例SLC26A4 c.919-2A＞G杂合突变听障患儿的父母拒绝进行进一步基因诊断。此外，本研究中22例耳聋易感基因筛查阴性的新生儿在后续生长发育中出现了听力损失，这也提示我们仅仅依靠联合筛查并不能检出全部的潜在听力损失者，后续针对耳聋基因的靶向测序或全外显子测序可作为诊断听障患儿病因的临床路径的补充和完善。因此，如何改进听障患儿的病因诊断路径，加强对育龄夫妻的科普宣教，提高自愿受检人群的比例，将成为笔者接下来的研究方向。

综上所述，本研究对扬州地区新生儿的听力与耳聋易感基因联合检测的结果进行分析，证明耳聋易感基因检测是预估新生儿先天性耳聋易感性的有效辅助手段，大规模开展、联合筛查可及早发现听力损失患儿，有助于患儿早期诊断和早期干预，还可为突变携带者家庭提供婚育及再生育指导。目前本地区耳聋出生缺陷防控主要以出生后进行筛查的三级防控为主，但仅在出生后进行“亡羊补牢”不足以实现出生缺陷的闭环防控，因此，对有生育意愿的育龄夫妇应广泛宣教孕前检查的重要性，将预防关口提前至孕前检查，提早发现耳聋高危家庭，以期覆盖全周期的耳聋出生缺陷防控。