毛白杨雌、雄花蕾总黄酮含量及抗氧化活性的比较

李卓俊，吴翠，徐博，宋平平，刘震营，巢志茂（中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

毛白杨（Populus tomentosaCarrière）为杨柳科杨属落叶大乔木，在华北地区有大量的种植，属于常见的造林绿化树种，其叶、树皮和雄花序均可作为中药使用。1977年版《中国药典》中记载毛白杨干燥雄花序是中药杨树花的植物来源，具有化湿止痢的功效，用于治疗细菌性痢疾和急性肠炎[1]。在《中药大辞典》中记载，毛白杨树皮具有清热利湿的功效，主要用于治疗赤白痢疾、日久不止、淋浊白带、急性肝炎、支气管炎、肺炎、蛔虫、习惯性便秘等[2]。临床上使用毛白杨花、叶和树皮用于治疗急性菌痢、骨肉瘤、外伤感染[3-4]。杨树花目前还用作兽药，用于治疗牛羊猪等的痢疾、腹泻等疾病，并在山东等地有食用的历史[5-7]。毛白杨的化学成分主要有黄酮类、甾醇类、有机酸类、酚及其苷类[8-10]，具有抗炎镇痛、抗腹泻、抑菌、抗氧化等药理活性[11-13]。

雌雄异株植物是指在具有单性花的种子植物中，雌花和雄花长在不同的植株中[14]。对于雌雄异株植物性别之间存在的理化性质和药效活性的差异的研究，早期仅见极少的报道[15]。有研究通过高效液相色谱指纹图谱方法结合多元统计分析方法对毛白杨的树皮进行雌雄的比较发现，雌株中micranthoside 的含量高于雄株，而siebolside B、樱花苷、异樱花苷、isograndidentatin A 的含量低于雄株[16]。有研究通过顶空进样固相微萃取气质联用法对毛白杨花蕾的挥发性成分进行比较发现，雌株中2-环己烯-1-酮、苯甲酸苄酯和苯甲酸甲酯的含量高于雄株，而苯甲酸乙酯的含量低于雄株[17]。通过磁共振技术结合多元统计分析对毛白杨雌雄花蕾进行化学成分研究发现，雌雄花蕾间主要差异成分有胡萝卜苷、β-谷甾醇、熊果酸和白桦脂酮酸，均为雄株中的含量高于雌株[18]。尽管存在一些成分含量高低不等的现象，但对于雌雄异株植物毛白杨的花蕾尚未见总黄酮含量及抗氧化活性差异的研究报道。

本文收集了成年毛白杨雌株和雄株的花蕾，通过亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定了总黄酮的含量，通过DPPH 和ABTS 自由基清除法评价了体外抗氧化活性，并进行了雌雄组之间的比较，为毛白杨的开发利用了提供科学依据。

1 材料

1.1 试药

于2020年2月23日至28日在北京市东城区东直门北大街、通教寺、民安小区、安定门东大街、青龙胡同和朝阳区黄金苑等地点（东经116°22'53'' ～116°26'57''， 北纬39°52'36'' ～39°57'17''）采集了成年毛白杨的花蕾，阴干。性别是通过该植株之后形成的花序和果实确认。雌株花蕾标记为F1 ～F11，雄株花蕾标记为M1 ～M11。经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定为杨柳科植物毛白杨的干燥花蕾，样品贮藏于中国中医科学院中药研究所。

亚硝酸钠、氢氧化钠（分析纯，北京化工厂），硝酸铝[分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司]，儿茶素对照品（批号：154-23-4，纯度：98%，成都埃法生物科技有限公司），6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸[Trolox，货号：238813，Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司，纯度≥97%]，2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH，批号：D1915107，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥97%），2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[ABTS，货号：A1888，纯度≥98%，Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司]；无水乙醇（分析纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司），甲醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪器

TU-1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Ohaus CP224C 型电子天平[精度：0.1 mg，奥豪斯（上海）仪器有限公司]；ME155DU型电子天平[精度：0.01 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DFT-50A 型手提式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；DFD-700 型双列四孔电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 将样品粉碎，过40目筛。精密称取2.0 g 粉末，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量后，水浴锅上加热回流30 min，放置室温后，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.1.2 显色溶液的制备 精密称取亚硝酸钠5.0 g，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，摇匀即得5%NaNO2溶液。精密称取硝酸铝10.0 g，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，摇匀即得10%Al（NO3）3溶液。精密称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，摇匀即得1 mol·L-1NaOH 溶液。精密称取DPPH 7.00 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL 棕色量瓶中，摇匀即得0.07 mg·mL-1DPPH 溶液。精密称取ABTS 0.10 g，加水溶解并定容至25 mL 棕色量瓶中，摇匀即得7 mmol·L-1ABTS 溶液。精密称取过硫酸钾0.19 g，加水溶解并定容至5 mL 棕色量瓶中，摇匀即得140 mmol·L-1K2S2O8溶液。

2.2 总黄酮的含量测定

参考相关文献[19-20]并对测定方法进行优化。

2.2.1 标准曲线的制备 精密称取儿茶素10.80 mg，加水溶解并定容至100 mL 量瓶中，摇匀，即得0.11 mg·mL-1儿茶素对照品溶液。精密吸取0.11 mg·mL-1儿茶素对照品溶液1.4、1.6、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL 量瓶中，加入6 mL 水，摇匀，加入5%NaNO21 mL，摇匀，静置6 min，加入10%Al（NO3）31 mL，摇匀，静置6 min，加入1 mol·L-1NaOH 溶液10 mL，加水至刻度线，摇匀，放置10 min 后测定，以70%甲醇为空白，在510 nm 的波长处测定吸光度，以儿茶素对照品溶液质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.2 供试品溶液的测定 精密吸取毛白杨雌、雄花蕾的供试品溶液20 μL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度。根据标准曲线计算毛白杨雌、雄花蕾中总黄酮的含量。

2.3 DPPH 自由基清除能力测定

参考相关文献[21-22]并对测定方法进行优化。

2.3.1 标准曲线的制备 精密称取Trolox 对照品10.14 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL 棕色量瓶中，摇匀，即得0.20 mg·mL-1Trolox 对照品溶液。精密吸取Trolox 对照品溶液20、40、60、80、100、120 μL，置于5 mL 棕色量瓶中，加入0.07 mg·mL-1DPPH 溶液2 mL，摇匀，加甲醇至刻度线，摇匀，避光静置30 min，在517 nm 波长下测定吸光度为A0，计算DPPH 自由基清除率，以Trolox 对照品溶液的浓度（μmol·L-1）为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线。

DPPH 清除率（%）＝[1-（A1-A0）/A2]×100%

式中：A1为70%甲醇空白组的吸光度；A2为DPPH 溶液对照组的吸光度。

2.3.2 供试品溶液的测定 将“2.1.1”项下供试品溶液稀释10 倍，精密吸取20 μL，按“2.3.1”项下方法测定吸光度A0，平行测定3 次，取平均值，计算DPPH 自由基清除率。根据标准曲线结合稀释程度计算TEAC 值。TEAC 值是指在对DPPH 自由基相同的清除率情况下，样品所对应的Trolox 浓度。

2.4 ABTS 自由基清除能力测定

参考相关文献[23-24]并对测定方法进行优化。精密吸取140 mmol·L-1K2S2O8溶液176 μL 置于具塞锥形瓶中，加入7 mmol·L-1ABTS 溶液10 mL，摇匀，室温且黑暗条件下反应16 h，即得ABTS 储备液。使用前量取一定量的ABTS 储备液，加无水乙醇稀释，在734 nm 波长下测定吸光度，直至稀释后的吸光度为（0.70±0.02），即得ABTS 工作液。

2.4.1 标准曲线的制备 分别精密称取Trolox 对照品0.24、1.02、1.50、2.14、2.60、3.16 mg 置于5 mL 棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，摇匀，即得0.048、0.204、0.300、0.428、0.520、0.632 mg·mL-1Trolox 对照品溶液。精密吸取各质量浓度的Trolox 对照品溶液20 μL，置于5 mL 棕色量瓶中，加入ABTS 工作液3 mL，摇匀，避光反应4 min，在734 nm 的波长下测定吸光度为Aa，计算ABTS 自由基清除率，以Trolox 对照品溶液的浓度（mmol·L-1）为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线。

ABTS 清除率（%）＝[1-（Ab-Aa）/Ac]×100%

式中：Ab为70%甲醇空白组的吸光度；Ac为ABTS 工作液对照组的吸光度。

2.4.2 供试品溶液的测定 将“2.1.1”项下供试品溶液稀释10 倍，精密吸取20 μL，按“2.4.1”项下方法测定吸光度Aa，平行测定3 次，取平均值，计算ABTS 自由基清除率。根据标准曲线结合稀释程度计算TEAC 值。TEAC 值是指在对ABTS 自由基相同的清除率情况下，样品所对应的Trolox 浓度。

3 结果

3.1 总黄酮含量测定结果

按“2.2.1”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y＝31.50X-0.01（r2＝0.9995），线性范围为0.0069 ～0.0259 mg·mL-1。 按“2.2.2”项下方法对22 个毛白杨花蕾样品进行总黄酮含量的测定，结果见表1。

表1 毛白杨花蕾的总黄酮含量的测定结果(n ＝3)Tab 1 Total flavonoid content of flower buds of Populus tomentosa(n ＝3)

3.2 DPPH 自由基清除法

按“2.3.1”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y＝1.187×104X+2.53（r2＝0.9990），线性范围为0.0081 ～0.0049 mg·mL-1。按“2.3.2”项下方法对22 个毛白杨花蕾样品的DPPH 自由基清除能力进行测定，其TEAC 值结果见表2。

3.3 ABTS 自由基清除法

按“2.4.1”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y＝105.25X+1.22（r2＝0.9998），线性范围为0.0480 ～0.6320 mg·mL-1。按“2.4.2”项下方法对22 个毛白杨花蕾样品的ABTS 自由基清除能力进行测定，TEAC 值结果见表2。

表2 毛白杨花蕾的体外抗氧化活性(n ＝3)Tab 2 In vitro antioxidant activity of flower buds of Populus tomentosa (n ＝3)

3.4 总黄酮含量的统计学分析

运用IBM SPSS Statistics 25 对毛白杨花蕾的总黄酮含量进行统计学分析，结果呈明显的正态分布（P＞0.05）；对其进行独立样本t检验，结果显示雌雄花蕾之间的总黄酮含量差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中雌花蕾的总黄酮含量为24.30 ～27.56 mg·g-1，雄花蕾的总黄酮含量为25.54 ～32.55 mg·g-1。雌雄花蕾之间的结果比较显示，雄花蕾中的总黄酮含量高于雌花蕾，说明毛白杨的总黄酮含量与性别有关。

3.5 体外抗氧化活性的统计学分析

运用IBM SPSS Statistics 25 分别对毛白杨雌雄花蕾的TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）进行统计学分析，结果认为均呈明显的正态分布（P＞0.05）；对DPPH 法和ABTS 法各自的TEAC 值分别进行独立样本t检验，结果显示这两种方法的TEAC 值在雌雄花蕾之间差异均具有统计学意义（P＜0.05）。其中DPPH 法毛白杨雌、雄花蕾的TEAC 值分别为15.62 ～24.22 mmol·L-1和20.13 ～29.03 mmol·L-1；ABTS 法毛白杨雌、雄花蕾的TEAC 值分别为19.08 ～21.61 mmol·L-1和20.90 ～26.34 mmol·L-1。雌雄差异之间的结果比较显示，雄花蕾的TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）均大于雌花蕾。TEAC 值越大，对DPPH 和ABTS 自由基的清除能力越强，抗氧化能力越强，即雄花蕾的抗氧化活性高于雌花蕾。

3.6 毛白杨花蕾总黄酮含量与其抗氧化活性的相关性分析

运用IBM SPSS Statistics 25 软件，将22 个毛白杨花蕾的总黄酮含量与其对应的DPPH 法和ABTS 法所测定的TEAC 值分别进行相关性分析，结果见表3。两种活性方法测定的TEAC 值均与总黄酮含量成正相关，说明毛白杨花蕾的抗氧化活性与其总黄酮含量成正相关。

表3 毛白杨花蕾总黄酮含量与其抗氧化活性的相关性Tab 3 Correlation between total flavonoid content and antioxidant activity of flower buds of Populus tomentosa

4 讨论

本研究通过亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定了毛白杨雌雄花蕾的总黄酮含量，结果显示雌花蕾的总黄酮平均含量为25.60 mg·g-1，雄花蕾的为30.39 mg·g-1，两者差异有统计学意义，雄花蕾的黄酮含量高于雌花蕾。黄酮类成分多具有抗氧化、抗菌、抗炎等活性[25]，这可能是选择雄花序入药的理由之一。此外，通过DPPH 和ABTS 自由基清除法评价和比较毛白杨雌雄花蕾的体外抗氧化活性，认为雌雄花蕾均具有一定的抗氧化活性，雌花蕾的平均TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）分别为19.99 mmol·L-1和19.97 mmol·L-1，雄花蕾的平均TEAC 值（DPPH 法和ABTS 法）分别为23.91 mmol·L-1和23.44 mmol·L-1，雌雄花蕾的比较差异均具有统计学意义，雄花蕾两种方法的TEAC 值均高于雌花蕾，表明雄花蕾的抗氧化活性高于雌花蕾。两种方法测得的毛白杨花蕾的体外抗氧化活性均与其总黄酮含量成正相关，表明黄酮类成分可能是杨树花的重要有效成分。

与毛白杨一样来源于雌雄异株植物的中药还有杜仲、天花粉、桑叶等，毛白杨的花蕾入药是有明确的性别限制，但是，其他品种在实际的中医临床应用中并未进行性别的区别和限制。毛白杨花蕾的抗氧化活性与雌雄有关，其他品种的中药是否也存在性别间活性大小的差异，临床上是否需要进行性别的区分，本研究的结果给出了一个新的启发。雌雄异株植物在外观性状上是存在一定差异的，开展化学成分含量、药效活性以及临床效果的差异的研究，不仅将揭示雌雄异株植物的性别本质，还将有可能在提高中医药的临床疗效提供新的思考角度。