心肌缺血再灌注损伤及其潜在治疗靶点LCN2的研究进展

朱香梅，石雨荷，李晴，朱珏，刘湘丹，3，王智，3，童巧珍，3*（1.湖南中医药大学药学院，长沙 410208；2. 湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室，长沙 410208；3. 湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，长沙 410208）

冠心病（coronary heart disease，CHD），又称为缺血性心脏病，是最常见的心血管疾病，由于心肌供血中断而导致冠状动脉阻塞的一种心肌病变[1]。目前，在我国心血管病中心发布的《国家心血管病报告2018》中，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）患病人数已接近3 亿，同时死亡率高居首位，远超肿瘤及其他疾病[2]。冠心病最直接的后果是急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），对于减少心肌梗死面积最有效的治疗是及时进行再灌注。临床上常采用再灌注治疗来改善梗死区的血液循环，但往往会导致心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[3]。MIRI 与多种病理生理特征有关，包括钙超载、氧自由基生成、内皮功能障碍、免疫反应、线粒体功能障碍、心肌细胞凋亡和自噬以及血小板聚集[4]。通过对基因表达综合数据库的分析，研究者发现脂质运载蛋白-2（lipocalin-2，LCN2）是MIRI 的潜在治疗靶点[5]。LCN2 也称为嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）或24p3，是一种25 kDa的分泌蛋白，它可以被许多细胞分泌，如巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞和脂肪细胞[6]。LCN2 可调节缺血再灌注的心脏功能，作为显性心脏病的诊断和预后标志物[7]，并且LCN2 在其他疾病中的作用也十分广泛。本文综述了近几年MIRI 的发生机制、相关通路及其潜在治疗靶点LCN2 相关的研究进展。

1 MIRI 发生机制

当器官的血液供应中断（缺血）然后重新建立（再灌注）时，就会发生缺血再灌注损伤，导致线粒体中活性氧（reactiveoxygen species，ROS）的“爆发”。MIRI 是引发心肌细胞坏死和凋亡的一种病理过程，尤其是当冠状动脉灌注恢复时。血流的重建通过ROS 的积累、细胞离子稳态的干扰和细胞死亡的炎症反应触发缺血组织的进一步损伤，而ROS 能够刺激组织炎症并诱导NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症体激活，从而引发无菌性炎症疾病[8]。心肌缺血再灌注时，氧化能力极强的氧自由基通过攻击膜成分中的不饱和脂肪酸，生成脂质过氧化物，引起细胞膜功能单位结构和功能的障碍[9]。有研究发现在心肌缺血后，心肌组织中便能观察到少量氧自由基的产生，而再灌注后数秒钟至一分钟后以后氧自由基快速增长到35%[10]。此外，心肌缺血时心肌膜结构损伤，Na+/Ca2+离子通道异常，细胞外钙离子呈浓度梯度进入细胞内，引起心肌钙超载，并且在心肌再灌注时加重，钙超载引发线粒体膜通透性转换孔（mito-chondria permeability transition pore，mPTP）开放、线粒体膜电位异常、促凋亡因子释放等，最终导致心肌细胞死亡[11]。黄艳平等[12]研究发现内吗啡肽-1（EM-1）可能通过抑制mPTP 的开放，保持线粒体结构和功能的完整性，减少线粒体中细胞色素C（Cyt-C）的释放，下调相关凋亡蛋白caspase-3 的表达，减少心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。MIRI 的发生一般由炎性反应、氧化应激、线粒体功能障碍、细胞内钙超载等多种因素导致。由于MIRI 的发生较复杂，还需要对其病理机制进一步深入研究。

2 MIRI 的相关信号通路

2.1 促损伤作用相关的信号通路

核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一种能调节基因表达的核转录因子，在包括缺血性病理学在内的许多疾病中的细胞凋亡和炎症信号传导非常重要。不活跃的NF-κB 位于细胞质中，当NF-κB 被激活时，IκB-α被IκB 激酶（IKKβ）磷酸化，然后降解，导致NF-κB 亚基从细胞质转移到细胞核。早期研究证明NF-κB 通路在MIRI 中是诱导心肌细胞氧化应激启动和炎症反应发生的一个重要途径，而槲皮素、赤芍总苷、绞股蓝皂苷、红景天苷和三七皂苷R1可以通过抑制NF-κB 信号通路保护缺血心肌[13]。Kim等[14]研究发现三白草酮通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 和Jun 激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）信号通路的磷酸化从而保护局部MIRI。缺血再灌注过程中，先天免疫的激活是急性炎症反应的重要组成部分。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）是种系编码的跨膜蛋白，来源于Toll 基因家族，在检测许多微生物模式和激活先天免疫系统中起着至关重要的作用。TLRs 家族成员主要有13 个（TLR1 ～13），它们在心脏细胞中都会表达，其中TLR4 在心肌细胞中表达最高[15]。缺血再灌注损伤时的炎症反应与TLRs 密切相关，TLR4 缺陷小鼠心肌缺血再灌注时，炎症和组织损伤也明显减轻，并且吴茱萸次碱可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路保护缺血心肌[16]。此外，Wnt 信号在心脏中是静止的，但受到损伤后会被激活，而在MIRI 过程中，激活Rho/Rho 激酶信号通路调节细胞凋亡途径可促进心肌进一步损伤[11，17]，目前这条通路在MIRI 的机制研究中报道较少。

2.2 保护作用相关信号通路

磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）通过影响下游丝氨酸/苏氨酸激酶（PKB 或称为Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶3β（GSK3β）等蛋白通路，抑制心肌细胞凋亡，减轻氧化应激造成的细胞损伤，同时有效减少了心肌中的炎症反应，最终在MIRI 过程对心肌起到保护作用。Liao 等[18]研究发现胰岛素样生长因子-1（IGF-1）可通过抑制心肌细胞凋亡来保护缺血再灌注损伤的心脏，且IGF-1 的抗凋亡作用是通过激活PI3K/Akt 通路介导的。GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，抑制其磷酸化可激活核因子E2 相关因子2（Nrf-2）相关通路，发挥氧化应激作用，进而改善MIRI[19]。Sulaiman 等[20]发现对氧磷酶2（PON2）可通过激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，减少心肌细胞线粒体功能障碍和氧化应激，保护心肌免受急性缺血再灌注损伤。内皮细胞虽然对缺血不太敏感，但与心肌细胞相比，它们对心脏缺血再灌注非常敏感，缺血再灌注通过破坏内皮屏障功能增加内皮通透性，进而加剧缺血再灌注后心肌的炎症。Kong 等[21]研究结果表明热休克蛋白A12B（HSPA12B）过度表达可通过激活PI3K/Akt/mTOR 信号来改善内皮完整性减轻急性MIRI，而靶向HSPA12B 表达可能是治疗MIRI 的另一种治疗方法。

3 LCN2 的概述

3.1 LCN2 的结构

LCN2 是由198 个氨基酸残基组成的分泌型糖蛋白，LCN2 老鼠同系物用Lcn2 或Ngal 表示[22]。与大多数其他蛋白质家族不同，lipocalin成员是根据其氨基酸序列的相似性来鉴定的，共享更少的序列同一性。LCN2 作为脂质运载蛋白，主要功能是运输亲脂性小分子，与脂质运载蛋白家族成员共享一个二级和三级结构特征——脂质运载蛋白折叠，这是它们作为各种配体的转运或载体蛋白的基本功能[23]。与lipocalin 家族的其他成员一样，LCN2 具有3D 桶状结构，它的结合位点具有极性，并且它的宽度足以与某些蛋白质结合[24]。LCN2 的极性结合位点结合的是硫酸盐离子或不定共纯化脂肪酸[25]。Coles 等[26]通过核磁共振阐明了人类LCN2 的三维结构，结果显示LCN2 包含1 个氮端310螺旋，然后是8 个反平行的β链，1 个α螺旋和1 个碳端β链，β链形成1 个桶状结构，其壁由2 个β片组成，第一个由β2 ～β4 链组成，第二个由β6 ～β8 链组成，另外还观察到3 个β凸起，其中1 个在第1β链和2个在第6β链。正是这种空腔和结构的多样性导致了LCN2 各种不同的结合模式，每种模式都能够适应不同大小、形状和化学特性的配体。

3.2 LCN2 的受体

LCN2 蛋白属于lipocalin 蛋白家族的一员，被归类为转运蛋白，其结构和功能均具有多样性[27]。LCN2 受体有3 种：黑素皮质素受体4（MC4R）、LCN2R、脂蛋白受体相关蛋白2（LRP2）。MC4R 主要在下丘脑室旁核中表达，在能量平衡中起着核心作用。LCN2R 是一种内吞受体，进入细胞参与铁稳态的控制，LRP2 是一种多配体内吞受体，在多种细胞中表达，已有研究证实了LCN2R 在内髓集合管（IMCD）细胞中的顶端表达[28]，LCN2 与LRP2 之间的相关性具有最高的预测置信度，早期研究认为LRP2 可能作为LCN2 的细胞受体，协助其细胞摄取[29]。LRP2 在许多类固醇反应组织中表达，如男性和女性生殖器官；在非哺乳脊椎动物中，LRP2 在其生长和发育过程中起着重要作用[30]。Plieschnig等[31]研究发现LCN2-LRP2 复合物对人类先天免疫反应的结构有较大影响。此外，成骨细胞衍生的LCN2 还可以穿过血脑屏障，与下丘脑室旁核和腹内侧神经元中的MC4R 结合，并激活MC4R依赖的厌食（食欲抑制）途径，表明LCN2 是一种具有代谢调节作用的骨源性激素，以MC4R 依赖的方式抑制食欲[32]。

4 LCN2 的表达

LCN2 具有多种作用，包括铁转运、趋化作用和抑菌作用。LCN2 作为一种生长因子，可以促进细胞分化和增殖[33]。有研究发现糖皮质激素暴露显著增加绝经前女性皮下和网膜脂肪组织中Lcn2基因的表达，但绝经后女性中Lcn2基因的表达没有增加[34]。另外，脂多糖（LPS）、IL-6、IL-17、IFN-γ等促炎细胞因子可诱导LCN2的表达，表明LCN2 在促炎反应中起重要作用[35]。LCN2 在包括血浆、血清、尿液和心包液在内的样品中以多种变体形式存在。LCN2 可以以130 kDa LCN2-基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）复合物的形式存在，或者以25 kDa 单体或56 kDa 同型二聚体存在于健康个体中[36]，临床研究表明，LCN2 表达增加与异位疾病（心血管疾病、肠道炎症、神经炎症）以及其他代谢疾病（2 型糖尿病和肥胖）密切相关[37]。因此，LCN2 被认为是许多病理状况的可靠生物标志物。

4.1 心脏组织

心脏是一个新陈代谢高度活跃的器官，其铁平衡尤为重要。越来越多的证据表明，LCN2 是一种促炎症因子，与肥胖相关的心血管并发症紧密相连，被认为是急性心力衰竭患者心肾综合征早期检测的生物标志物[38]，可通过升高细胞内铁水平诱导心肌细胞凋亡，介导对心脏功能的有害影响[39]。LCN2 水平升高与心肌肥厚密切相关，体外研究证明了LCN2 在心肌细胞肥大和心肌细胞增殖减少的源头中发挥直接作用[40]。Xiong 等[41]研究发现LCN2 是miR-138 的直接靶点，miR-138 过度表达通过下调LCN2 的表达抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。LCN2 在缺血再灌注后心脏病变的发展过程也占有重要地位。在心脏移植后的缺血再灌注小鼠模型中，使用抗LCN2 抗体可减少巨噬细胞和中性粒细胞向缺血区的浸润，抑制巨噬细胞的M1 极化，从而减轻MIRI[42]。Yang 等[7]研究结果表明抑制LCN2 表达可改善缺血再灌注小鼠离体心脏的功能，与线粒体功能恢复和磷脂重塑有关。另外，LCN2 可通过与含铁细菌铁载体结合，从而限制细菌生长，在细菌感染的先天免疫反应中发挥关键作用[43]。铁参与调节各种细胞机制，包括氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激和自噬，所有这些都可能在受到干扰时导致心脏功能障碍，而LCN2 与铁超载及缺铁性心肌病的关系还在研究中[44]。临床研究证实了心肌梗死患者血浆中的LCN2 水平较正常人明显升高，且敏感性强，推测其可与心肌酶谱CK-MB、肌钙蛋白I（cTnI）一起作为心肌梗死早期预测和诊断的指标[45]。

4.2 肝脏组织

肝脏是脂肪和碳水化合物代谢的重要器官，肝脏的功能损害直接影响整个生物体。Xu 等[46]研究发现肝细胞是导致细菌感染或肝部分切除术（PHx）后血清LCN2 蛋白水平升高的主要细胞类型。LCN2 过表达可阻止新生脂肪生成、脂质过氧化和细胞凋亡，从而预防脂肪性肝炎，而促炎性TNF-α、IL6 和抵抗素治疗可上调HepG2 细胞中的LCN2，因此，LCN2 被认为是肝脏对炎症的保护成分[47]。LCN2 是肝脏脂质稳态的关键调节剂，通过调节脂滴包被蛋白5（PLIN5）的表达来控制细胞内脂滴的形成，用于治疗与脂肪堆积和脂肪变性相关的肝病[48]。此外，Alwahsh 等[49]的研究证实了果糖饮食上调肝脏LCN2 的表达，这与氧化应激和线粒体功能障碍指标的增加有关，LCN2 可能参与肝脏保护。在多种肝发病机制模型中LCN2 表达水平有明显变化，如急/慢性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病、急/慢性肝衰竭等病中LCN2 表达水平升高[50]，因此，LCN2 是一种值得信赖的肝损伤生物标志物。

4.3 其他

LCN2 开始在胚胎阶段表达，在肾脏、肺、骨骼、大脑等器官组织中被激活。Karoui 等[51]研究发现白蛋白通过钙依赖性内质网应激激活导致LCN2 过度表达，进而触发肾小管细胞凋亡和肾损害。LCN2 在脂多糖诱导的急性肺损伤中具有诊断作用，小鼠肺和血液中LCN2 的表达均显著上调[52]。Costa 等[53]研究发现骨骼中的LCN2 过度表达通过调节关键分泌因子和细胞因子的表达来改变骨髓微环境，从而调节造血干细胞生态位行为，同时增强幼鼠的造血干细胞定位和老年小鼠的红细胞产生。当然，LCN2 的不平衡表达也与一些器官组织中肿瘤的形成和发展有关。有研究报道LCN2 的表达与子宫内膜癌侵袭性肿瘤特征、远处转移扩散和生存率降低有关[54]，临床研究表明，MMP-9/LCN2 复合物水平的升高与胃癌患者生存率的降低相关[55]。Villodre 等[56]首次证明了LCN2在乳腺癌患者中的表达水平显著升高，并且LCN2 促进了乳腺癌异种移植小鼠模型中的肿瘤生长、皮肤浸润和转移。LCN2 在多种癌症中过度表达，通过促进肿瘤细胞生存、生长和转移加快肿瘤的发展，提示LCN2 可作为肿瘤化疗敏感性的潜在靶点。

5 LCN2 与MIRI 相关信号通路的研究

随着MIRI 在分子生物学领域研究的不断深入，越来越多的细胞信号转导通路被证实在MIRI 过程中通过影响各种损伤机制发挥着关键的调控作用，而LCN2 是许多疾病相关信号通路的介质。Huang 等[57]研究发现维生素D 促进LCN2 启动子甲基化以抑制LCN2 蛋白表达，减少LCN2-核糖体蛋白S3（RPS3）结合、RPS3-NF-κB 结合，从而增加了肿瘤对顺铂的化疗敏感性。Song 等[58]发现了LCN2 在心功能不全发展中的新机制，LCN2 通过释放危险相关分子模式（DAMP）高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和随后的TLR4 依赖性信号，诱导NLRP3 炎症体激活，而NLRP3 炎症小体激活会影响糖尿病和心血管疾病。此外，有研究表明LCN2 可以通过PI3K/AKT/MTOR 信号通路抑制炎症，揭示了LCN2 在肝脏保护中的作用机制、通过激活ERK/GSK3β/β-连环蛋白信号通路促进卵巢癌细胞增殖和迁移[59-60]。LCN2 是Wnt/β-catenin 信号转导的下游靶点，可能作为一种适应性措施被激活，以应对高渗压引起的应激[28]。LCN2/JAK2-STAT3 通路参与了脊髓损伤后神经毒性小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，已被证实是一种有希望的治疗策略[61]。目前，LCN2 在MIRI 促进损伤、产生保护作用信号通路的研究较少，尤其是LCN2 如何调控各信号通路影响MIRI 的进展尚不清楚，需要进一步的实验证明。

6 结论及展望

MIRI 的损伤机制主要包括氧化应激、钙超载、炎症反应、线粒体代谢障碍、血管内皮功能障碍和细胞自噬。不同细胞信号通路通过调控不同的MIRI 机制产生不同的作用，促损伤效应NF-κB、TLRs、Wnt 信号通路病理生理机制是氧化应激和细胞凋亡、炎症反应、细胞坏死和细胞凋亡、钙超载、细胞纤维化和炎症反应。PI3K 的下游Akt、mTOR、GSK-3β等蛋白通路病理生理机制主要是氧化应激、炎症反应和钙超载。有研究证明LCN2 敲除小鼠在心肌梗死后心脏纤维化和炎症减轻，心脏功能良好[62]。MIRI 病理机制研究的不断完善，有助于挖掘更多与其相关的潜在治疗靶点，为缺血性心脏病相关疾病或其并发症的治疗提供参考。

LCN2 作为心脏缺血再灌注损伤期间炎症的潜在调节因子，在多种组织中表达上调，如心脏、肝脏、多种黏膜组织、肺和上皮组织，在这些组织中，LCN2 表现为急性期蛋白。在首次将LCN2 作为保证免疫平衡的重要因素后，LCN2的功能进一步扩展到许多生物过程，包括炎症、中毒、免疫防御、癌症等。在心肌缺血再灌注的早期阶段，对心肌细胞自噬的减弱增加了对应激诱导的细胞死亡的敏感性，而缺乏LCN2 却能够在缺血后引发更高的自噬反应，并免受细胞死亡和心脏功能障碍的影响。LCN2 是否可以作为心脏相关疾病生物标志物或者作为一个可靠的治疗靶点，还需要大量研究进一步证明。