水生动物病害数字化标本库的建设及其在水生动物医学专业上的应用探讨

谢 妙， 庞欢瑛， 周银环， 李长玲， 师尚丽

（广东海洋大学水产学院实验教学中心，广东 湛江 524088）

0 引 言

水生动物医学是一门研究水生动物病原、病理、疾病防控与治疗等方面的学科，是水产学科的重要组成部分。水生动物医学主要研究水产动物疾病的发生以及发展规律、病原的致病机制、病害的预防与治疗，以期为水产养殖病害提供诊断和治疗的理论基础和实践依据。水生动物病害生物标本是水生动物医学实验教学的重要道具，以直观、生动、全面展示方式为学生提供水产动物病害相关的临床特征、发展规律等学习资料，有助于加深学生对水生动物病害的理解和认知。但由于传统水生动物病害标本库的建设存在种种不足，比如标本来源途径有限、标本制作不规范、标本病害不典型、标本病原鉴定不明确、标本保存不当损坏等问题，直接影响实验教学的生动性和趣味性以及后续的学习过程［1］，从而影响实验教学的效果。本文将通过对我校水产学院实验教学中心现有的水生动物病害标本库存在的问题进行分析，然后在扩充标本库来源、建立水产动物病害标本制作和分类鉴定的标准、建立水生动物病害标本数字化标本库给出建议，并对数字化标本库在未来实验教学上应用进行探讨，以期为水生动物病害标本库的改造、数字化标本库的建设及其在教学上的应用提供参考。

1 我校水生动物病害生物标本库现有问题分析

1.1 标本库的现状

标本库的建设需要有专业的管理队伍和相应的管理规章制度，并需要长期的投入来完善标本库资源。本院水生动物病害标本库建立时间较早，在长期的投入和管理后已具有一定的规模。现有的标本库中水生动物病害标本从标本制作上可以分为浸制标本、玻片标本、整装制片标本，其中浸制标本数量最多；从标本物种来源来分又可以分为有病鱼类标本、有病甲壳类标本、有病贝类标本、寄生虫标本、病原微生物标本等。

标本库建设已久，现在存在的问题主要有：（1）标本种类和数量有限，由于病害标本主要来源于学生实习采样，病原宿主种类局限于几种常见的经济水产动物，标本的种类和数量尚需进一步扩充；（2）标本制作不规范，不同的水生动物标本的预处理方法和保存液的配方是不同的，而在学生采样时往往会对不同的物种来源的标本采用相同的制作方法，导致标本制作不规范；（3）病害标本不典型，病原鉴定不明确，由于水产动物疾病流行特点和区域养殖结构的差异，典型病害标本的来源有限，标本收集困难，再加上管理上的问题，导致部分标本的病害的病原鉴定也不明确，影响实验教学结果；（4）标本保存不当，有些标本制作年代久远，在保存过程中有可能会因为标本库环境变化、管理不到位导致标本损坏、变形、腐烂、丢失；（5）缺乏专业的管理人员和相应的管理规章制度，导致标本库的建设仍处于比较初级的探索阶段。

1.2 标本在实验教学应用中遇到的问题

水生动物病害标本是水生动物医学实验课重要的教学道具，也是学生直观了解病原体和病变组织形态特征的重要学习材料。但由于实体标本自身的局限性，在应用到实验教学实践中遇到的问题有：①展示模式单一。受限于标本自身的局限性，学生对标本的观察停留在病理切片的“二维观察”和大型标本有限视角的“三维观察”上，部分寄生虫和藻类标本体积小不易观察，加之长期浸泡的标本褪色、变形影响观察结果，导致实验教学结果不佳；②学习途径有限。标本库仅在实验教学期间开放，相较于互联网资源的可随时随地查阅调取、全天候开放的优点，标本库提供的学习途径显得模式单一而有限，不利于课外学习的扩展，再加上标本库中空气甲醛浓度高，不利于身体健康，学生在标本库学习的时间也相对短暂，多数停留在走马观花的学习形式；③与生产实践关联度不够。水生动物病害标本比较直观的展示了病害的临床特征和发展规律，有助于病原的鉴定和病害的诊断的学习，但不能提供与生产实践关联度更高的病害防控、治疗的信息。如若利用互联网的优势，在病害标本的资料库中扩充经典病害防控、治疗案例，以文字、图片、视频等多媒体的形式展示，将理论学习与生产实践更紧密的联系起来，可加深学生对水生动物病害防控的认知和理解，加强标本库建设与生产实践的联系。

2 实体标本库建设的改造

2.1 扩充水生动物病害标本库资源来源

水生动物病害标本库的资源主要来源于学生去野外或水产养殖公司实习时的采集，少数来源于教师社会服务采集。由于水产养殖病害季节性流行特点和养殖动物区域结构的差异性，采集到的标本物种局限于几种常见的养殖品种，采集地点也局限在近距离地区，标本库资源的种类和数量收到了很大的限制。为了解决这个问题，将采取以下措施来扩充水生动物病害标本的来源：①加强与水产企业的合作，如水产养殖企业和渔业药物服务公司，鼓励学生去一线生产实践中学习，从而能收集到更多的标本；②鼓励科研工作者参加更多社会服务，建立与养殖户良好的合作关系，不定期收集养殖户送检的水生动物病害样本；③在水生动物病害流行爆发的季节，组织师生去水产动物病害流行地采集标本或购买具有典型病理特征的标本；④加强与高校同行合作，共享数字化标本库的资源。

2.2 规范化水生动物病害标本的制作

水生动物病害标本通常使用浸制法制作，使用甲醛溶液和酒精溶液作为标本固定保持液，但对于不同物种的标本保存法也有所不同。

（1）有病鱼类标本。用于制作标本的鱼首先要进行去污和除黏液的预处理，再从胸鳍基部或腹鳍基部进行腹腔注射10%的福尔马林溶液，然后将标本放入5% ～10%的福尔马林溶液中进行固定，固定时间根据个体大小调整，待鱼体僵直后再转入5%的福尔马林溶液中长期保存［2］。

（2）有病甲壳类标本。甲壳类的动物首先要进行麻醉或杀死处理，可采用氯仿或乙醚麻醉，或采用窒息法杀死，避免直接浸泡固定液时出现附肢自切的现象［3］。固定后的甲壳类动物可放在15%的福尔马林与10%的甘油混合液里长期保存［4］。

（3）有病贝类标本。贝类标本可先用硫酸镁或多聚乙醛等药品进行麻醉处理，头足类的动物如乌贼、章鱼可用淡水麻醉，麻醉后的动物可以用70% ～75%的乙醇溶液进行固定和长期保存［3］。

（4）寄生虫标本。对于体积较大的寄生虫，如线虫、鱼怪等，可以经解剖和宿主分离，并用棉线固定在玻璃载片上与宿主存放在同一玻璃容器中，用10%的福尔马林溶液固定并长期保存；体积较小的寄生虫则单独分离出来在小体积的玻璃容器中用10%的福尔马林溶液固定并长期保存。

（5）微生物标本。引起水生养殖动物病害最主要的微生物病原体有弧菌、无乳链球菌、嗜水气单胞菌等细菌类病原体，水霉、镰刀霉菌为主的真菌类病原体，白斑病毒、虹彩病毒、神经坏死病毒等病毒类病原体，车轮虫、小瓜虫、瓣体虫等原虫类的病原体以及少数藻类病原体。细菌类、真菌类、原虫类、藻类的病原体可先进行对应的方法进行固定、染色、脱水后再用中性树脂进行封片长期保存［5］，病毒类的标本则提取核酸后扩增再-70 ℃下长期保存，或者制作DNA 条形码。此外，鱼类标本、甲壳类标本、贝类标本和较大的寄生虫标本应在制作之前进行拍照，尤其是病灶部分应进行微距拍照特写，避免长期浸泡或保存不当导致标本褪色、病灶部位变形。对于不易肉眼观察的较小的寄生虫、原虫类、藻类等病原体可以固定后制成临时水封片，在显微镜下拍照，然后再进行后续的处理制成长期保存的标本。

（6）病理切片标本。选具有典型病害代表的新鲜个体作为病理切片制作的对象，根据用途选取合适的体积和厚度的组织，按照各病变部位、性质的不同规范取材，再经过固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片贴片、染色和封片后制成高质量的病理切片标本［6-7］。

2.3 规范标本鉴定与分类

标本制作完成后，由专业的形态学分类专家对病害标本进行鉴定分类。病害标本按照病原宿主和对应的病原体按照各自的门、纲、目、科、属、种进行分类鉴定，鉴定结果尽可能分类至属、种级别［8］，对于难以鉴定的微生物标本可以提取核酸以后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增，产物经电泳和基因测序后获得DNA 条形码信息以便鉴定。鉴定完毕须对浸制标本、玻片标本贴标签处理，标签信息应详尽包括：标本编号、疾病名称、宿主和对应的病原体名称、拉丁文名称、采集地点、采集日期、保存介质、鉴定人员［9］，有DNA条形码的标本还应增加相应的二维码标识。标本制作完成后，建立电子档案，记录标本的图片和标签信息，保证标本的图片和实体、标签信息一一对应。

2.4 改善标本库环境和完善管理制度

标本库保存环境要求较低的温度和湿度，温度要求控制在15 ～20 ℃为宜，湿度要求控制在40% ～50%为佳［10］，避免太阳直射，可通过安装空调和除湿机来满足标本库对温湿度的环境要求。由于标本固定液通常为具有挥发性的乙醇和甲醛溶液，标本库建设还需要安装通风设备和消防设施。标本固定液在长期保存中会挥发或变质，标签也可能老化脱落，因此需要定期对标本保存的情况进行检查，对于变色变质的保存液需要更换或补充，脱落的标签需及时重新贴上，检查以半年1 次为佳。

完善标本库的管理制度主要从4 方面做起：①加强标本库的管理队伍的建设，包括设立专职管理人员、鉴定人员；②完善标本库的出入库管理，做到标本出入有记录可查，降低标本丢失、破损的几率；③完善标本库保存管理制度，规范标本的保存和检查方法；④规范化标本的采集、制作、鉴定、分类、来源扩充的标准。

3 数字化标本库的建设

已有不少高校和研究机构建立了数字标本库，包括人体寄生虫数字标本库［11-12］、兽医病理数字标本库［1］、植物病害电子标本库［13］等数字标本库，在理论教学和实验教学上发挥了重要的作用，但有关水生动物病害数字标本库的建立还是鲜见于报道。建立水生动物病害数字标本库，不仅有利于标本的长期保存、节约资源和保护环境，还能改善水生动物医学的实验教学效果，为了满足学科专业建设的需求，建立数字标本库势在必行。建造水生动物病害数字标本库的步骤如图1 所示。

3.1 标本的筛选

图1 水生动物病害数字化标本库建造流程

制作数字标本库之前应对标本进行筛选，用于制作数字标本库的标本应满足这些条件：①病害标本必须是能代表该病害的典型标本，具有该病害最典型的临床特征，能比较直观地展示该病害的发展规律；②病害标本应是近期制作或保存完好的标本，没有褪色、病灶模糊、变形的瑕疵；③病害标本应是经过明确的鉴定分类的标本，宿主和病原体的物种鉴定明确，相关存档信息详尽完整；④病理切片标本以及病原微生物封片标本应是制作精良、染色良好、代表典型、保存完好的标本。

3.2 标本图像采集和处理

建立数字标本库需要对经筛选的标本进行图像采集，包括病理切片标本、病原微生物封片标本、寄生虫标本、宿主标本等合格标本的图像采集。病理切片标本、病原微生物封片标本经筛选后，在显微镜下进行多角度、多方位的拍摄，如水霉的孢子囊和菌丝，石斑鱼弧菌病感染的前期、中期、后期病灶发展的病理切片，整理成套为图片集，能代表病原体的生活史和病害的发展规律。病毒类的病原体可增加电镜观察图和PCR电泳检测图。对于大型的宿主标本则需要进行全方位的图片采集以便于进行下一步的三维建模，每个标本需要拍摄40 ～50 张图片。大型宿主标本首先要进行支撑架固定，然后放置在固定电动转盘上，在合适的人造光源环境下进行全方位均匀的拍摄，以获得曝光强度相同、分辨率一致、景深大小相同的照片［1，14］。

采集完后的照片可输入到电脑中用图像处理软件如Photoshop进行处理，调整过曝、过暗的照片，弃用模糊、偏色的不合格的照片［15］。病害标本照片还应在照片上对典型的病理变化特征进行箭头标注，并注明标尺和病灶特征描述文字。对于微生物封片的照片，还应标注微生物的生理结构组成部分和染色方法。大型标本的图片经筛选处理后可用三维建模软件进行三维影像合成，成熟的合成软件有Strata Foto 3D［14］、Object2 VR［1］、AgiSoft PhotoScan［16］等。合成后的三维标本模型仿真度高，可任意旋转缩放，体验感大大提升。

3.3 数字化标本电子资源库建设

将经过筛选、处理后合格的照片以及三维模型转入电脑保存，并按照实体标本的分类排列进行整理，确保实体标本与数字标本一一对应。为了加强标本与生产实践连接的紧密性，建立电子档案，描述标本对应的病害病原体的基本信息概述、流行特点、致病机制、防治手段，并引入经典防治案例描述。为了拓展学生学习的途径和延长学习时间，利用互联网可随时随地访问的优势，将数字化标本电子资源库上传到服务器中，并在实体标本容器上贴上对应的二维码。学生可以通过手机扫描二维码或者电脑登录网站访问数字标本库，可以在参观标本库时即时学习和课后拓展学习，拓展学习途径和延长学习实践。

目前实验教学中心已经完成了部分水生动物病害的数字化标本的建设，并通过虚拟现实引擎Unity 3D来实现场景的交互和资源共享。在系统中，人们可以借助鼠标和键盘实现对标本进行缩放、结构分离、360°旋转等操作（见图2），点击“描述与案例”还能调取数据库中与该标本对应的病害的生物学信息和经典防治案例（见图3）。在未来将有更多的水生动物病害数字化标本被制作并收入到数据库中，进一步开拓标本库的建设，为水生动物医学的理论教学和实验教学提供了丰富的教学材料。

图2 部分水生动物病害数字标本系统展示图

图3 “描述与案例”资源调取图

4 数字化标本在教学中的应用

4.1 数字化标本库在水生动物病原生物学理论课上

的应用

在传统的水生动物病原生物学理论课的教学中，对于不同水生动物病害的病原体的形态、宿主组织病理变化等形态学知识的讲授，主要依靠文字描述结合黑白、彩色插图的讲解，讲授方式单一，学生对病原体和组织病理的变化也停留在“二维”的平面认知上。当有了数字化标本库资源后，教师在对理论知识的讲授同时还可以利用资源库中大量的数字标本来生动形象的展示病原体的形态、结构和宿主组织病理变化，让学生的认知从“二维”的平面飞跃到栩栩如生的“三维”立体上。此外，资源库中大量病害防治经典案例不但可以作为课堂上理论联系实践的实例讲解的材料，还可以作为学生课余学习、科研的学习材料，丰富了学生的学习途径，也延长了学习时间，加深了学生对水生动物病原生物学理论知识的理解。

4.2 数字化标本库在实验教学上的运用

水生动物病害标本是水生动物寄生虫学、水生动物细菌学、水生动物检验检疫学等实验课程的重要教学工具。传统实验教学中，教师组织学生参观实体标本并现场讲解是主要的实验教学方式。但由于标本经长期存放后，标本多已褪色，病灶和病变组织的观察也局限于有限角度的观察，而且和宿主一起的微生物病原体无法通过肉眼观察。当建立数字化标本库后，学生不仅可以现场观察实体标本，还可以通过手机扫描标本容器对应的二维码找到该标本对应的数字化标本，进行多方位的观察，并可以细致的对病原体和病变组织进行放大缩小观察，加深对病原体及其引起的病害的发生规律了解，提高了学生主动学习的兴趣，改善了实验教学效果。

4.3 数字化标本在其他方面的应用

随着标本数量的扩充和标本库建设的发展，标本库的资源量也将以日俱增。标本库的资源不仅可以作为学生课堂、课后的学习资料，还可以作为学生实验考试的重要工具。利用数字标本库进行实验考试省时省力，且可以构建多种考核方式来督促学生学习，有利于提高教学质量和考试效率［11］。此外，数字标本库建设完成后，数据库还可以对外开放，为校外水产从业人员的水产动物病害的诊断、防控提供参考，同时也有助于扩充标本库的来源，加强数字化标本库在实践上的应用。

5 结 语

我校水产学院多年来收集了大量的水生动物病害标本并建立了标本库，在水生动物医学人才培养方面发挥了重要的作用。但传统标本库在建设过程中难免遇到各种问题，如标本数量不足、鉴定分类不明确、保存不当等，且由于传统标本库自身的局限性，不能满足实验教学的需要，也不符合“双一流”专业的建设对实验室建设的要求。本文就现有的标本库建设存在的问题提出了改造方案和数字化标本库建造的方案，探讨了数字化标本库在理论教学和实验教学上应用的优势，为本校的标本库以及其他院校的标本库的改造和数字化建设提供了新思路。