栀子黄色素提取、精制及药理活性的研究进展

汤丽琴，刘昊澄，温 靖，徐玉娟，李 俊,

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610；2.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌 330045）

栀子（Gardenia jasminoidesEllis）是一种茜草科灌木，又名山栀子、黄栀子等，广泛分布于温带地区，属药食同源植物资源[1]。栀子黄色素是栀子果实提取物的主要活性成分之一，是目前应用比较广泛的天然水溶性色素。栀子黄色素的主要成分为藏花素和藏花酸[2]，其结构式如图1 所示。与合成色素相比，栀子黄色素安全性更高且具有一定的营养价值和保健功能，可作为食品添加剂应用于面条、饮料等的着色。此外，大量的研究也证明了栀子黄色素的主要成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理活性，具有广阔的开发前景[3]。然而，目前用于栀子黄色素提取精制的技术主要包括传统浸提法、超声波提取法、大孔吸附树脂法以及膜分离法等。这些方法较为落后，导致国内市场上高色价栀子黄色素产品较少，且价格昂贵，阻滞了栀子产业的发展。因此，需要研究出较为先进实用的提取精制技术，这对栀子黄色素产业的发展具有重要意义。此外，加大栀子黄色素功能活性的研究可以进一步扩大栀子黄色素的应用范围。本文主要对栀子黄色素的提取、精制及药理活性的相关研究进展进行了综述，以期为栀子黄色素在食品、药品及化工工业的深入研究和开发利用提供理论依据。

图1 藏花素（a）和藏花酸（b）的化学结构Fig.1 The chemical structure of crocin (a) and crocetin (b)

1 栀子黄色素的提取

1.1 传统溶剂浸提法

传统溶剂浸提法是根据相似相溶原理获取目标成分的提取技术，具有工艺简单、设备投资少等优势。然而却需要较长的提取时间及较高的温度，增加了不耐热活性物质热降解的风险。此外，大量提取剂的回收也是阻碍该方法广泛应用的一大难题。传统水浸提法提取栀子黄色素的过程中会导致大量糖类物质浸出，且得率较低，因此研究人员常加入有机试剂进行强化提取[4]。刘和平[5]以安徽奕龙栀子为原料，采用50%乙醇浸提3 次，每次浸提2 h，最终得到得率为2.05%的栀子黄色素。张鹤[6]采用热回流法对浙江安吉栀子进行提取，所得栀子黄色素的产率为7.00%。栀子黄色素的得率与提取条件密切相关，进行相应的工艺优化可进一步提高栀子黄色素得率[7]。Yang 等[8]通过响应面法对江西栀子果实中栀子黄色素的提取进行了工艺优化，并确定了栀子黄色素的最佳提取条件：乙醇质量分数为51.3%，温度为70.4 ℃，提取时间为28.6 min，栀子黄色素的得率为8.41%。综上结果可知，不同产地栀子得率差异显著，这可能与栀子种植环境差异有关。

1.2 超声波提取法

超声波是一种浸提辅助方式，它是一种机械波，可以被介质吸收，具有一定的振动空化、机械粉碎作用。色价和得率是评价栀子黄色素品质的重要指标，栀子黄色素色价越高其品质越好。邹立君[9]比较了传统浸提法和超声辅助提取法对栀子黄色素得率和色价的影响，结果表明超声辅助提取法获得的栀子黄色素色价和得率均更高，超声辅助提取法制备的栀子黄色素色价达45.2，相较于传统浸提法提高了1.2 倍。然而在张鹤[6]的研究结果却发现超声辅助提取法和传统浸提法对栀子黄色素含量的影响并无显著性差异。虽然超声辅助提取相对传统浸提设备资源花费更高，但是却显著缩短了提取时间，这对后期的研究与发展具有重要意义。

1.3 其它提取法

除上述提取方法外，栀子果实中栀子黄色素的提取方法还有微波提取法和机械化学法等。涂华等[10]比较了微波辅助提取技术与热回流提取技术对栀子黄色素品质的影响，结果表明微波辅助提取技术获得的栀子黄色素具有更高的色价（79.09），较热回流提取技术提高了1.16 倍。Jun 等[11]利用微波辅助提取系统，对栀子黄色素的提取率进行了研究，结果表明栀子黄色素含量比常规提取方法高出50%。与传统溶剂浸提法相比，微波辅助提取是在有机溶剂浸提的基础上增加了微波处理以提高栀子黄色素的得率，为实现天然产物高效工业化提取提供了新的路径。另外，Xu 等[12]采用一种基于机械化学方法从栀子中选择性提取栀子黄色素，确定球磨条件为30%（g/g）活性炭，200 r/min 行星式球磨机球磨5 min。然后用80%乙醇溶液和1%（g/g）吐温20 在75 ℃下提取5 min，得到得率为1.45%的栀子黄色素。与传统的溶剂浸提方法相比，这种新的萃取技术大大简化了分离过程，具有有机溶剂消耗少、操作简单、过程快、效率高等优点。

从上文提及的几种提取方法可以看出，传统溶剂浸提法比较常用，但效率较低；微波辅助提取技术虽然具有较高的栀子黄色素得率，但微波提取时原料内外温度不均一，易造成活性成分的损失；机械化学法和超声辅助提取不仅具有能够加快提取速度，还能获得较高的提取得率，是用来提取栀子黄色素的较为理想的提取技术。目前，较少研究者采用酶法技术提取栀子果实中的栀子黄色素。酶法提取是较为温和、绿色的提取技术，在未来有很大的发展前景，后期研究人员可着手于这方面的研究。此外，若能进一步优化栀子黄色素提取工艺体系，将推动栀子黄色素的产业化发展，经济效益可观。

2 栀子黄色素的精制

栀子黄色素粗提物存在色价低，杂质多等问题，不能直接用作食品添加剂，需要对其进行纯化。栀子黄色素粗提物的杂质主要有以栀子苷为主的环烯醚萜苷类化合物和绿原酸等。栀子苷容易引起着色食品绿变，绿原酸的存在会导致食品颜色变暗[13]。因此，需要去除这些杂质以获得较高品质的栀子黄色素。目前，用来分离纯化栀子黄色素的方法有柱层析法（大孔吸附树脂法、聚酰胺层析法、制备液相色谱法）、膜分离法以及不同分离方法的结合等（表1）。

表1 栀子黄色素纯化方法比较Table 1 Comparison of purification methods of gardenia yellow pigment

2.1 柱层析法

大孔吸附树脂由于具有多种官能团、高机械强度和多孔能力，被广泛用于富集生物活性化合物。周厚宁等[14]研究了5 种不同类型的大孔树脂对栀子黄色素的静态吸附及解吸性能，结果表明HP2MGL 大孔树脂具有最优的解吸与吸附性能，并以此树脂为填充材料得到色价为340，得率为2.2%的栀子黄色素。任志军[15]采用大孔树脂精制栀子黄色素，在考察的13 种大孔树脂中，HPD100A 对栀子黄色素的吸附量大，选择性高，所得栀子黄色素色价值高于360，产率为0.87%。聚酰胺是一种高分子聚合物，由酰胺键聚合而成，可与酚类、酸类等富含羟基的化合物形成氢键而被吸附，常被用来纯化天然产物。王先敏[16]以聚酰胺为栀子黄色素的纯化剂，建立了富集纯化栀子黄色素的工艺路线，纯化前后样品中的栀子黄色素含量由1.83%提升至25.96%，色价高于500，得率为3.89%。制备液相色谱法是通过高负载、高分离度的制备柱来实现化合物较高程度的分离与纯化。Choi 等[17]首先将栀子黄色素粗提液通过硅藻土层过滤，然后再采用半制备液相色谱法对栀子黄色素滤液进行分离。用水-甲醇（1:1）混合物洗脱该柱15 min，然后以2.5 mL/min 的流速用甲醇-水（1:1）至100%甲醇线性梯度洗脱50 min，收集保留时间为16.1 min 的黄色液体，真空干燥得到分析纯黄色固体藏花素，得率为0.7%。目前，大孔吸附树脂法和聚酰胺层析法是栀子黄色素纯化的常用方法，这是因为其具有低成本、高产量的优点。虽然制备液相色谱法纯化效果远高于大孔吸附树脂法及聚酰胺层析法，但无法实现工业化生产且得率较低。

2.2 膜分离法

膜分离技术是以化学位差及外界能量差形成的推动力而实现不同成分分离的方法。姚立霞[18]通过陶瓷微滤膜分离纯化栀子黄色素提取液，确定了微滤膜工艺条件：操作压力差为0.12 MPa，温度为35 ℃，孔径大小为0.2 μm。该技术实现了栀子黄色素的富集及其它杂质大分子的去除，最终得到的栀子黄色素中藏花素含量为68%，色价为124.5，得率为18%。郑光耀等[19]将栀子黄色素粗提液经微滤膜过滤后，用石油醚纯化微滤液，再将微滤液用反渗透膜减重浓缩，最后冷冻干燥得栀子黄色素粉末样品，其色价为589，得率为56%。郭晶莹[20]以栀子果粉为原料得到栀子粗提液，采用多级低分子醇-盐双水相体系分离纯化，得到栀子黄色素浓缩液，再经过有机溶剂重结晶得到纯度为95.5%，收率为86.6%，色价为535 的栀子黄色素。李宏文等[21]通过膜分离技术获得色价高于500，得率为70%的栀子黄色素。该方法操作简单，条件温和，但膜容易受外界环境污染，过滤时间长，此外膜的使用寿命也是一个值得考虑的问题。

2.3 其它方法

当单一的分离方法达不到预期的分离效果时，研究者通常会结合多种分离纯化方法实现目标成分的有效分离。刘超等[22]首先采用孔径为200 nm的陶瓷膜在温度为30 ℃，压力为0.2 MPa 的条件下对栀子黄色素粗提液进行澄清处理，再分别用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇进行萃取；回收正丁醇萃取液，选用HP2MGL 大孔树脂进行柱层析，收集20%～70%乙醇洗脱液；最后采用3000 Da 超滤膜对20%～70%乙醇洗脱液进行分离纯化，冷冻干燥得到色价为760，得率为19.3%的栀子黄色素。聂斡等[23]结合聚酰胺柱和大孔树脂柱纯化栀子黄色素粗提液，得到色价为853，得率为7.28%的栀子黄色素。Feng等[13]首先采用LX-60 大孔树脂对栀子黄色素进行初步纯化，栀子黄色素中藏花素含量达29.6%，再通过反相中压液相色谱进行二级分离，得到色价为756，藏花素含量为60.8%的栀子黄色素，回收率为81.2%。现有的提纯方法尚不能同时满足纯度高、环保且大规模生产的要求，而目前国内外对栀子黄色素的纯化技术正在向绿色、安全方向推进。因此，仍需探索更为简单快速且环保的提取纯化技术。

3 栀子黄色素的药理活性

藏花素和藏花酸是栀子黄色素的主要成分，能够对某些疾病起到预防及治疗的作用。药理学研究结果已经证明栀子黄色素中的藏花素及藏花酸类成分具有各种药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、抗炎、保肝活性以及降血糖、降血脂等。

3.1 抗氧化活性

藏花素是栀子黄色素抗氧化活性的主要贡献者，包括清除不同类型自由基和亚硝酸盐的能力、抑制3-乙基苯并噻唑烷-6-磺酸自由基阳离子以及延长脂质过氧化等[24]。陈丽萍等[25]研究表明栀子黄色素具有较强的抗氧化活性，其中对DPPH 自由基、ABTS 自由基、羟基自由基的IC50分别为0.19、0.51、0.19 mg/mL。在一定浓度范围内，抗氧化活性随栀子黄色素浓度的增加而增强。Shang 等[26]比较了江西、安徽、湖南、四川以及河南五省的栀子黄色素的清除ABTS 和DPPH 自由基的能力，结果表明湖南栀子具有最高的抗氧化活性，这可能与其具有较高的藏花素含量有关。Soeda 等[27]研究表明，藏花素可通过抑制N-SMase 激活、神经酰胺生成和JNK 磷酸化参与对氧化应激诱导细胞死亡的保护作用。与此研究不同的是，在体外抗氧化研究中，总藏花素含量与体外抗氧化性能之间存在直接相关性[28]，而这种抗氧化功能可能与藏花素结构中附着的糖有关，这在Chen 等[29]的研究中已有证明。栀子黄色素的抗氧化潜力是其许多药理活性的基础，这也是栀子黄色素具有较多药理活性的原因之一。此外，由于其抗氧化特性，栀子黄色素可以显著保护视网膜免受缺血/再灌注（IR）损伤[30]。总的来说，栀子黄色素可能具有作为一种抗氧化剂应用于食品及医药行业的潜力。

3.2 抗肿瘤活性

很多研究者已经发现藏花素和藏花酸具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的特性。细胞凋亡是导致细胞生长减少的重要机制。如图2 所示，细胞凋亡机制主要可分为两条途径：线粒体介导的内部途径和死亡受体介导的外部途径[31]。藏花素在人肺癌中的独特促凋亡特性已被证明是通过 Caspase-8-9-3级联反应实现的[32]。在人宫颈癌细胞系和耐药细胞系中，藏花素可诱导Bax 的上调以及Bcl-2 的下调[33]。此外，抗肿瘤活性的其它分子机制也有报道。Chong等[34]报道了藏花素可以抑制AKT/mTOR 活性从而诱导肝癌细胞自噬凋亡。Wang 等[35]发现藏花素对人皮肤癌细胞SGL-1 和A431 的增殖有剂量依赖性影响，这可能与下调JAK/STAT 通路有关。Mir 等[36]证明了藏花酸通过抑制雌激素受体α和组蛋白去乙酰化酶2 介导的信号级联抑制MCF-7 细胞增殖，但对正常细胞系（L-6）无明显影响。其他研究表明，栀子中的藏花素和藏花酸可以通过细胞毒性抑制癌细胞的增殖。在头颈部癌细胞系（HN-5）中，藏花素通过细胞毒性诱导细胞凋亡，并且使细胞对辐射诱导的毒性和凋亡更敏感[37]。另一项对MCF-7、A549 和HeLa 人癌细胞的研究表明，藏花酸诱导细胞毒性，抑制癌细胞生长，并以时间和浓度依赖的方式导致癌细胞死亡[38]。

图2 藏花素/藏花酸对细胞凋亡途径影响的机制图Fig.2 The mechanism diagram of the effect of crocin/crocetin on the apoptosis pathway

3.3 抗抑郁活性

Ghalandari-Shamami 等[39]的研究表明，藏花素治疗可减少青春期雄性大鼠的抑郁行为和慢性束缚应激诱导的形态学变化。Ardebili 等[40]研究发现藏花素对OP 诱导的小鼠抑郁行为具有抗抑郁作用，这可能是因为藏花素对海马脑源性神经营养因子发挥了作用。在强迫游泳和习得性无助试验中进行连续7 d 的栀子黄色素治疗处理，结果表现出显著的抗抑郁反应，并抑制海马中真核延伸因子2 的磷酸化[41]。此外，在Bahareh 等[42]进行的一项研究中，使用小鼠在两种不同的急性和亚急性给药方案中评估了藏花素和藏花酸的抗抑郁作用。结果表明，藏花酸在治疗抑郁症方面比藏花素更有效。Nikbakht 等[43]评估了藏花素对志愿者的影响，结果显示藏花素显著减轻了受试者的抑郁症状。Razavi 等[44]揭示了藏花素的长期抗抑郁活性也可能是通过CREB 介导的。尽管试验显示了积极和有希望的效果，但仍需要全面和深入地研究来分析栀子中栀子黄色素成分的毒性和副作用。

3.4 抗炎活性

Liu 等[45]以40 mg/kg 的藏花素给药Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠，发现大鼠的MMP-1、MMP-3 和MMP-13 水平恢复至正常水平。藏花素还能抑制CIA大鼠踝关节组织和血清中促炎细胞因子的表达。同样，另一项研究发现，藏花素显著抑制LPS 诱导的人成纤维样滑膜细胞中促炎细胞因子的表达[46]。藏花素通过阻断小鼠NF-κB/STA T6 信号通路从而下调Th2 细胞介导的免疫反应，改善特应性皮炎症状[47]。Godugu 等[48]发现藏花素通过上调Nrf2 的表达，下调IL-6、TNF-α以及NF-κB 的表达对雨蛙素诱导的急性胰腺炎有潜在的调节作用，结果揭示定期摄入藏花素有利于胰腺健康。Hossein 等[49]在肾缺血-再灌注（IR）损伤的大鼠模型中，表明用藏花素（400 mg/kg）预处理导致细胞氧化还原状态（硫代巴比妥酸活性物质）显著降低，随后抗氧化能力升高。采用维生素D3诱导的大鼠冠状动脉粥样硬化模型的研究证实了藏花素通过促进M2 巨噬细胞极化和可能通过抑制NF-κB p65 核易位来抑制脂肪生成和减轻炎症，这有助于冠状动脉粥样硬化的治疗[50]。

3.5 保肝活性

20 mg/kg 的藏花素可以改善双酚A 处理大鼠的肝损伤程度，并提高甘油三酯和肝酶的水平[51]。在一项双盲临床实验中，藏花素降低了脂肪生成相关基因的mRNA 表达以及非酯化脂肪酸和胆固醇的含量，显著改善了非酒精性脂肪肝病患者的肝功能和甘油三酯[52]。Ping 等[53]证明了藏花素治疗可以显著减少四氯化碳处理小鼠肝细胞的破裂及变形性。Ke 等[54]发现藏花素预处理可有效预防脂多糖/D-半乳糖胺诱导的暴发性肝功能衰竭。其潜在机制与NF-κB 的调节、Bcl-2 家族和Caspase 家族中凋亡蛋白的调节有关。此外，藏花素对吗啡和尼古丁诱导的小鼠肝毒性具有保护作用，这是通过增加肝脏重量、降低平均肝细胞直径和肝中静脉直径、降低肝酶和一氧化氮水平来实现的[55]。此外，藏花素还可以通过激活AMPK信号来抑制脂肪的形成，促进脂肪酸的β氧化，从而改善脂肪肝和代谢紊乱[56]。这些研究表明藏花素可能是临床治疗肝病和相关代谢紊乱的潜在选择。

3.6 降血糖

据研究报道，藏花素作为栀子黄色素中的主要成分，对心血管疾病的治疗具有较好的效果。α-葡萄糖苷酶可以将机体内的碳水化合物酶解成单分子的葡糖糖并进入血液，从而升高血糖水平，这和许多代谢紊乱疾病有着密不可分的联系。黎砚书等[57]将栀子黄色素作用于四氧嘧啶糖尿病模型小鼠，结果表明，栀子黄色素可抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制小肠吸收，并且在一定程度上能够降低小鼠体内的血糖水平。此外，另一项研究结果表明，在饮食诱导的高脂血症大鼠中，在25～100 mg/kg 的日剂量范围内，总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯和极低密度脂蛋白胆固醇的水平在经西红花苷治疗10 d后均显著降低[58]。

3.7 降血压

高血压是一种病因尚不清楚的慢性病。Razavi等[59]的研究结果表明，藏花素对二嗪农（DZN）亚慢性毒性大鼠有升高收缩压、减慢心率的作用。Imenshahidi 等[60]发现藏花素可剂量相关性的降低醋酸去氧皮质酮诱导的高血压大鼠的平均动脉血压和心率。相似的研究结果在另一项研究中也有发现，Higashino 等[61]确定了藏花素对心血管系统的影响，他们发现藏花素可显著提高易中风的自发性高血压大鼠的收缩压，此外，进一步的实验结果表明，藏花素的降压作用可能与增加NO 的生物利用度有关。

4 结语

近年来，伴随着研究者对栀子黄色素的日益重视，栀子黄色素的药理活性及功能逐渐进入人们的视野。本文围绕栀子黄色素的提取、精制技术以及药理活性三个方面的研究进展进行综述，从以上结果可以得出栀子黄色素提取精制的常见方法有：传统溶剂浸提法、超声波提取法、柱层析法以及膜分离法等。此外，栀子黄色素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及降血糖降血压等药理活性。

就目前研究成果而言，未来亟需解决的问题仍然存在。其一，对于栀子黄色素的提取精制可以采用多种方法联用技术，使提取纯化后的产品达到理想效果；其二，针对栀子黄色素的抗氧化、抗肿瘤等药理活性在动物模型、代谢组学、肠道微生物菌群宏基因组学水平上进行构效关系研究；其三，虽然栀子黄色素在体内外模型中均表现出较好的活性，但仍需要进一步证实栀子黄色素地有效利用及其在临床上的可能应用；其四，需要补充对栀子黄色素的毒理学研究和安全性评价，以保证人们对栀子黄色素的安全性要求。综上所述，栀子黄色素作为一种天然色素，市场前景广阔。鉴于栀子黄色素具有多种功能特性，未来可大力发展其作为新型食品强化剂和重要的药物载体原料。