牦牛胶原蛋白肽降血糖效果研究

李 金，黄 彪，刘惠考，陈 烁，雷绍南，容明强，谢华平,

（1.青海省德令哈市畜牧兽医站，青海德令哈 817000；2.青海瑞肽生物科技有限公司，青海德令哈 817000；3.湖南师范大学生命科学研究院，湖南长沙 410006）

青海是全国最大的牦牛生产基地，牦牛总数占全国的三分之一以上，盛传为“世界牦牛之都”[1]。独有的高原环境、天然的放养方式，使牦牛拥有极强的免疫力、可靠的安全性和独特的营养价值[2]。其中，以牦牛皮为原料，通过酶解法制备具有抗高血压、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等活性的胶原蛋白肽[3−5]，在食品、医药和美容行业均具有巨大的应用前景。

食源性多肽作为天然降糖药物已引起广泛关注，像苦瓜肽、大豆肽和燕麦肽等植物源肽已被证明具有降血糖作用和高安全性特点[6−8]。近年来动物源的胶原蛋白肽同样被广泛研究[9−11]，田许等[9]研究表明，以深海鲑鱼的鱼皮为原料提取的胶原蛋白肽可以改善高脂饲料喂养的大鼠体内脂质代谢紊乱，降低胰岛细胞损伤，提高胰岛素的生物学活性以改善糖代谢异常；王莹等[10]研究表明，石斑鱼胶原蛋白肽交叉苦瓜素可促进糖尿病模型小鼠的脏器损伤修复，提高其自身免疫能力起到降血糖效果；王军波等[11]研究表明，猪胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）能活化免疫细胞[12]，提高小鼠机体的免疫力，一定程度地降低血糖。目前，牦牛皮胶原蛋白肽的降血糖功效还未见报道。

为了进一步拓展牦牛皮胶原蛋白的功能多样性，提高牦牛皮的附加值，促进牦牛产业的开发，本研究首次选用青海牦牛皮，通过酶切的方法提取低分子胶原蛋白肽，并检测其对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型的降血糖作用和促进高糖损伤INS-1 胰岛细胞增殖作用，为研究牦牛胶原蛋白肽降低血糖的功效提供数据支持，为开发辅助降血糖的功能性食品提供实验依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛皮 青海瑞肽生物科技有限公司；小鼠INS-1 胰岛细胞 中国科学院动物所；SPF 级昆明雄性小鼠（20±2）g，60 只，4 周龄，实验动物合格证号SCXK（湘）2019-0004 长沙史莱克景达动物实验中心；胃蛋白酶（10 万 U/g）、碱性蛋白酶（20 万 U/g）生工生物有限公司；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸（451 Da）、杆菌肽（1422 Da）、抑肽酶（6511 Da）、细胞色素C（12327 Da）

上海源叶生物科技有限公司；四氧嘧啶 Solarbio公司；二甲盐酸双胍释缓片 悦康药业；RPMI 1640培养基 德国默克；CCK8 试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；上述试剂纯度均为分析纯，其余试剂为实验室常规试剂或规格，水为超纯水。

5810 系列高速冷冻离心机 德国艾本德；JTMF65 胶体磨 中山市运鸿机械有限公司；GelDoc XR Biorad 凝胶成像系统 美国Bio-Rad 公司；Waters 2695 高效液相色谱 美国沃特世；TSKgel G2000 SwXL 体积排阻色谱柱 月旭科技；HY-45 生物摇床 武汉汇诚生物科技有限公司；2XZ-4 真空冷冻干燥机 临海市永昊真空设备有限公司；Mco-15Ac CO2培养箱 日本三洋公司；ELx808 酶标仪 美国BioTek 公司；YP20002 电子天平 上海佑科；三诺血糖试纸 三诺生物传感股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牦牛胶原蛋白肽的制备 参考王杉杉等[2]的方法并稍作修改，取50 g 新鲜牦牛皮，切成面积为1×1 cm2大小，料液比为1:5 g/mL 的5%纯碱浸泡8 h脱脂除杂，前处理好的牛皮选用胶体磨充分匀浆，随后加入0.05 mol/L 的醋酸溶液，料液比为1:5 g/mL，制得牦牛皮匀浆液。牦牛皮匀浆液中加入1.5 g 胃蛋白酶，pH 调至2～3，温度24 ℃，酶解8～12 h 后，100 ℃高温使酶失活10 min，0.1 mol/L NaOH 调节明胶液pH 至9，加入0.3 g 碱性蛋白酶，温度50 ℃，酶解4～6 h。酶解结束后，将酶解液100 ℃煮沸30 min，10000 r/min 离心去除残渣，0.45 μm 过滤后得到胶原蛋白肽酶解液，冷冻干燥后制得牦牛胶原蛋白肽，并通过SDS-PAGE 凝胶电泳进行鉴定，电泳条件：浓缩胶恒压80 V，分离胶恒压100 V。

1.2.2 牦牛胶原蛋白肽的分子量大小及分布 根据食品安全国家标准《GB 31645-2018 食品安全国家标准 胶原蛋白肽》进行分子量分布的检测[13]。配制浓度为1 mg/mL 的标准品乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸（451 Da）、杆菌肽（1422 Da）、抑肽酶（6511 Da）、细胞色素C（12327 Da）以及牦牛皮胶原蛋白肽溶液，经0.22 μm 膜过滤，待用。采用HPLC 法测定牦牛皮胶原蛋白肽分子量分布状况，色谱条件：TSKgel G2000 SwXL，300 mm×7.8 mm，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速0.5 mL/min，检测波长220 nm。流动相为乙腈:水:三氟乙酸，体积比为40:60:0.05，采用100%流动相等梯度运行40 min，以标准品分子量对数lgMW为纵坐标，保留时间t 为横坐标建立标准曲线，采用手动积分的方式测定不同分子量活性肽的占比。

1.2.3 动物分组和处理 动物饲养于SPF 级动物房（湖南师范大学），动物房环境温度为20～25 ℃，12 h照明/12 h 黑暗明暗交替，可自由饮水与进食，动物适应一周后按体重随机分成5 组（n=6）：正常组，模型组，牦牛胶原蛋白肽组（50 mg/kg，该浓度降血糖效果不佳未进行后续的指标检测），牦牛胶原蛋白肽组（200 mg/kg），二甲双胍组（200 mg/kg），按照文献报道的糖尿病小鼠进行造模[14−16]，禁食不禁水16 h 后，腹腔注射四氧嘧啶200 mg/kg（四氧嘧啶临用前用生理盐水配制），正常组注射等体积的0.9%生理盐水，72 h 后尾部采血血糖仪测定空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L 的动物灌胃给药，每天1 次，连续灌胃14 d，正常组和模型组给予等体积0.9%生理盐水。

1.2.4 小鼠体重、血糖及其它血液指标的测定 各组小鼠连续灌胃14 d，将4 组小鼠只禁食不禁水过夜，于次日早上9:00 空腹称量每组小鼠体重和尾部取血测定小鼠空腹血糖值[17]。末次给药后，禁食12 h，眼球取血，分离血清，分别送至湖南师范大学校医院进行低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）含量的测定。

1.2.5 小鼠胰腺组织病理检测 将小鼠处死后取胰腺组织，置于10%甲醛溶液中固定24 h，用乙醇溶液进行脱水，经常规石蜡包埋后制作组织切片（100 μm）；切片经脱蜡水洗后，进行苏木精-伊红染色，于光学显微镜下观察胰腺组织的病理学变化[18]。

1.2.6 牦牛胶原蛋白肽对高糖损伤INS-1 胰岛细胞模型的影响 将INS-1 胰岛细胞置于RPMI 1640 培养基（含10%胎牛血清）中，于37 ℃，饱和湿度，5% CO2的培养箱中培养。将INS-1 胰岛细胞进行传代并调节细胞密度为2.5×104个/mL，均匀接种于96 孔板，每孔100 μL 培养24 h 后，分别设置对照组（正常培养基）、高糖模型组（25 mmol/L 葡萄糖）、牦牛胶原蛋白肽处理组（样品溶解于25 mmol/L 高糖培养液中，用0.22 μm 的滤器过滤，分别稀释到终浓度为0.04、0.2、1、5 mg/mL），继续培养48 h，每组设置5 个平行。各组细胞干预结束后，按CCK8 试剂盒测定INS-1 细胞活性[19]。

细胞存活率（%）=（OD 实验组/OD 对照组）×100

1.3 数据处理

所有数据均以平均值±标准差（Mean±SD）形式表示，GraphPad Prism 5 软件进行统计分析。各组进行组间比较之前先进行正态分布和方差齐性检验，组间比较采用one-way ANOVA 进行统计检验，P<0.05代表有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 牦牛胶原蛋白肽的分子量

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高、分布最广的功能性蛋白，在牦牛皮中以Ⅰ型胶原蛋白为主，呈现典型的三螺旋结构[20]。如图1A 所示，牦牛皮经胃蛋白酶提取，泳道1 中，在相对分子质量150 kDa 附近出现两条泳带，分别为α1 和α2 链，在相对分子质量200 kDa 附近出现1 条泳带，为β链，进一步使用碱性蛋白酶酶解，在泳道2 中可见胶原蛋白的三螺旋结构被充分酶解成低分子量牦牛胶原蛋白肽，与孙爱平[3]研究的牦牛胶原蛋白提取结果相符合。根据《GB 31645—2018 食品安全国家标准 胶原蛋白肽》的定义，胶原蛋白肽是指以富含胶原蛋白的新鲜动物组织（包括皮、骨、筋、腱、鳞等）为原料，经过提取、水解、精制生产的，相对分子质量低于10000 Da（含量≥90%）的产品[13]。如图1B 和表1 所示，双酶解后牦牛胶原蛋白的分子量基本上小于细胞色素C，牦牛胶原蛋白肽分子量<10000 Da 的肽段占99.36%，说明本研究制得的牦牛胶原蛋白肽符合国家标准。

图1 牦牛胶原蛋白肽的分子量分布Fig.1 The molecular weight distribution of yak collagen peptides

表1 牦牛胶原蛋白肽分子量分布Table 1 The molecular weight distribution of yak collagen peptides

2.2 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病小鼠的体重影响

Ⅰ型糖尿病的起始症状大多为“三多一少”，因胰岛素的缺乏，机体不易储存能量，容易引起消瘦，体重持续下降[14]。给药的2 周期间，观察到模型组小鼠多饮，多食，多尿，体毛松散无光泽，由表2 可知，与正常组相比，模型组小鼠体重在第7 d 和14 d 分别下降27.8%和38.4%，具有极显著性差异（P<0.01），而二甲双胍组和牦牛胶原蛋白肽组小鼠三症状均有一定程度改善。其中给药后第7 d 和第14 d，二甲双胍组的小鼠体重较模型组分别极显著增加18.4%（P<0.01）和27.6%（P<0.01）；牦牛胶原蛋白肽组小鼠较模型组显著增加7.2%（P<0.05）和21.4%（P<0.01），且第14 d 二甲双胍组与牦牛胶原蛋白肽组小鼠之间体重无显著差异，均起到改善小鼠体重的作用。

表2 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病模型小鼠体重影响（n=6）Table 2 Effect of yak collagen peptide on body weight of diabetic mice (n=6)

2.3 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

据报道[9−11]，鱼皮和猪皮酶解提取的胶原蛋白肽可通过提高免疫力，改善脂代谢，降低胰岛细胞损伤而起到降血糖的作用。经NCBI 序列比对，发现鱼和猪的Ⅰ型胶原蛋白氨基酸序列与牦牛Ⅰ型胶原蛋白高度相似，因此，推测牦牛皮酶解产物同样具有降血糖效果。如图2 所示，小鼠糖尿病模型建立后，与正常组（NC）比较，模型组（NM）小鼠给药第0、7 和14 d时，血糖值分别显著升高10.6、25.1 和21.8 mmol/L（P<0.01）。与模型组比较，二甲双胍组（PM）和牦牛胶原蛋白肽组（YP-200）在给药14 d 后，血糖含量分别显著降低9.5 和7.7 mmol/L（P<0.05），具有明显的降血糖效果，其中，牦牛胶原蛋白肽需灌胃14 d 以上才表现出显著性差异。

图2 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病模型小鼠的血糖影响（n=6）Fig.2 Effect of yak collagen peptide on blood sugar of diabetic mice (n=6)

2.4 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病小鼠血脂代谢的影响

机体内脂质代谢紊乱导致氧化应激加剧，进而对胰岛β细胞结构和功能产生影响，造成胰岛素生物活性降低，最终导致胰岛素抵抗和高血糖的发生[21−22]。因此，血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的含量反应了脂代谢絮乱程度。由表3 可知，连续灌胃给药14 d 后，与模型组相比，牦牛胶原蛋白肽显著降低糖尿病模型小鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）的含量（P<0.05），分别降低了14.9%、9.3%和26.5%，同时也改变了高密度脂蛋白含量但未出现显著性差异（P>0.05），综上表明牦牛胶原蛋白肽对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠并发的高脂血症具一定的调节作用，与以报道的鱼和猪皮提取的胶原蛋白肽具有同样的功效[9−11]，通过改善脂代谢絮乱程度，降低糖尿病模型鼠的血糖。

表3 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL、HDL 的影响（n=6）Table 3 Effects of yak collagen peptide on serum TG,TC,LDL and HDL in diabetic mice (n=6)

2.5 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病模型小鼠胰腺的影响

正常组小鼠胰腺组织结构完整且形态规则，胰岛细胞排列紧密且大小均匀，细胞质丰富无空泡化现象，正常分泌胰岛素足以自动调控血糖正常代谢（图3A）；模型组小鼠胰腺组织损伤严重、形态不完整，胰岛细胞出现萎缩，数目减少，有明显空泡产生（图3B）；但二甲双胍组和牦牛胶原蛋白肽组小鼠胰腺组织形态较为完整，胰岛细胞排列紧密、损伤有所减轻，空泡减少（图3C、D）。组织形态结果观察显示，通过口服牦牛胶原蛋白肽对四氧嘧啶所致的小鼠胰腺的损伤具有保护和修复功能，从而起到降血糖的效果。

图3 牦牛胶原蛋白肽对糖尿病模型小鼠胰腺组织形态的影响Fig.3 Effect of yak collagen peptide on pancreas histopathology of diabetic mice

2.6 牦牛胶原蛋白肽对高糖损伤INS-1 胰岛细胞模型的影响

胰岛β细胞功能受损和凋亡是糖尿病发病的主要诱因[23]，本研究中四氧嘧啶通过破坏胰岛β细胞，引起血糖升高，造成小鼠糖尿病。由图4 可知，与对照组相比，25 mmol/L 高糖模型组细胞活力显著下降，说明INS-1 胰岛细胞高糖损伤模型构建成功。与25 mmol/L 高糖模型组83.5%细胞活力相比，0.04、0.2 和1 mg/mL 的牦牛胶原蛋白肽的处理组细胞活力分别为87.6%、94.9%、104.5%（P<0.01），具有显著的损伤抑制作用，其中1 mg/mL 的牦牛胶原蛋白肽抑制作用效果最佳，对高糖损伤的INS-1 胰岛细胞模型具有修复作用。因此，推测在本研究中牦牛胶原蛋白肽可通过促进胰岛细胞的增殖和分化，增加胰岛素的分泌在动物模型中起到降血糖的效果。

图4 牦牛胶原蛋白肽对高糖损伤INS-1 胰岛细胞模型的修复作用（n=5）Fig.4 The repair effect of yak collagen peptide on the INS-1 pancreatic islet cell model damaged by high glucose（n=5）

3 讨论与结论

通过四氧嘧啶成功诱导糖尿病小鼠模型，表明以200 mg/kg 牦牛胶原蛋白肽连续灌胃给药14 d 后能起到明显的降血糖效果。在200 mg/kg 牦牛胶原蛋白肽的剂量下，可纠正四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型血脂代谢异常，并抑制高血糖下胰腺组织中胰岛细胞损伤的机制，从而有效控制糖尿病小鼠血糖升高，减轻机体糖尿病的症状，与田许等[9]、王军波等[11]和欧爱宁等[12]研究的海洋胶原蛋白肽和猪胶原蛋白肽通过改善脂代谢和提高机体免疫力从而达到降血糖相比，牦牛胶原蛋白肽具有相似的降血糖功效。本研究为牦牛胶原蛋白肽发现了新的功效，为后续牦牛胶原蛋白肽在降血糖药物和辅助降血糖功能性食品领域的应用提供了理论依据。但本研究中未对牦牛胶原蛋白肽的功能成分进行更深入研究，未明确具体降血糖的功效因子及其作用机制，以及更长给药周期下是否存在一定副作用，在今后的研究中应进一步推进具体降血糖功效因子和不同口服剂量与给药周期下的降血糖功效和副作用研究。