响应面法优化工业化独立发酵凝固型发酵乳的发酵工艺

黄 娟 ，黄燕燕，彭小霞

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640；2.广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 511356；3.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528225）

凝固型发酵乳区别于搅拌型发酵乳，质地更脆软嫩滑，没有强烈的拉丝状和糊口感，一直广受消费者的喜爱[1−3]。在凝固型发酵乳生产中，发酵剂的发酵特性（包括发酵剂的最适发酵温度和发酵时长）在风味形成及质构方面具有至关重要的工业意义，直接影响着发酵乳的品质[4−6]。但实际生产工艺中，常常受发酵温度波动（45 ℃的奶经过较长管线灌装及现场存放，产品最佳发酵温度往往将损失5～10 ℃）、发酵时长控制不及时（现场品控人员的采样时机延误）、发酵菌种配比不适宜、接种后灌装延误等因素的影响导致发酵终产品的质构风味不符合预期。

目前，鲜少有文献针对乳品生产工艺中实际出现的波动因素进行研究报道，常见报道是对实验室阶段配方或基础工艺参数进行研究的，例如，陈文璐等[7]优化了干酪风味发酵乳的发酵配方中涉及的白砂糖、稳定剂和干酪粉的添加量以及发酵剂接种量四个变量因素；蔡达等[8]优化了干酪制作工艺中涉及的发酵剂添加量、拉伸温度和拉伸时间三个因素；胡盼盼[9]优化了副干酪乳杆菌发酵沙棘酸奶配方涉及的沙棘汁、白砂糖添加量和发酵剂添加量因素。同样未见针对工业化凝固型发酵乳生产过程中参数优化的相关应用报道，常见的仍然是对某单一原料或是添加剂或是常规的基础工艺条件对凝固型发酵乳的理化特性的影响，例如，孙敏等[10]研究了低聚果糖对低脂凝固型发酵乳品质的影响，邱爽等[11]研究了细菌素bifidocin A 对凝固型发酵乳品质及贮藏性能的影响。

本研究以燕塘乳业工业化灌装的液态乳基料（未发酵的独立塑料杯装的凝固型发酵乳基料）为样本，针对生产中实际出现的凝固型发酵乳质构不稳定情况以及区别于实验室条件的生产不利因素，对上述发酵温度波动、发酵温度、发酵时长、发酵菌种配比和灌装后温度波动及剪切破坏进行模拟分析，掌握各个可控及不可控的单因素对产品品质的影响程度及通过响应面分析法掌握发酵温度、发酵时长、发酵菌种配比可控组合因素对产品品质的影响程度并预测最优解条件，为工业化凝固型发酵乳产品的品质稳定性控制和工艺优化提供科学依据，方便生产应对各种突发状况及时作出正确响应，减少不必要的成本浪费。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生牛乳 优质乳工程巴氏杀菌乳，广东燕塘乳业股份有限公司；白砂糖 东方先导（湛江）糖酒有限公司；复配菌种型号1（低黏，嗜热链球菌:德氏乳杆菌乳亚种=1:2，活菌数不低于1.35×1012CFU/g）和型号2（高黏，嗜热链球菌:保加利亚乳杆菌=1:1，活菌数不低于6.68×1011CFU/g）、复合乳化稳定剂（明胶、双乙酰酒石酸单双甘油酯、果胶） 丹尼斯克（中国）有限公司；低聚果糖 量子高科（广东）生物有限公司；稀奶油 雀巢（中国）有限公司；乳清蛋白粉戴维林贸易（广州）有限公司；氢氧化钠 AR，广州化学试剂厂。

Eppendorf 5427R 离心机 德国艾本德股份公司；Eppendorf 移液器 德国艾本德股份公司；明澈TM-D 超纯水仪器 RephiLe Bioscience Ltd.；FM30-D实验室高剪切分散乳化机 上海弗鲁克科技发展有限公司；APV-1000 均质机 SPX Flow Technology；Eco 电位滴定仪 Metrohm；MARS iQ 流变仪HAAKE；DV2T 旋转粘度计 Brookfield。

1.2 实验方法

1.2.1 工业化独立发酵凝固型发酵乳的制备 生牛乳经80 ℃、15 s 预巴杀处理冷却至60 ℃，循环在线剪切系统加入白砂糖、低聚果糖、稀奶油、乳清蛋白粉、复合乳化稳定剂（明胶、双乙酰酒石酸单双甘油酯、果胶）、水，高剪切循环15 min，再冷却至10 ℃定容，经在线管道过滤网过滤，预热至65 ℃经脱气、均质处理，95 ℃、300 s 杀菌，冷却至（42～44）℃，在线无菌操作台接种，可能需暂存一定时间再灌装（待装罐到灌装机的管线较长，存在一定的产品温度损失，灌装得未发酵完成的液态乳基料），推至温房发酵至（60～70）°T，入冷库冷却，经检验合格后得可出货的成品。该灌装工艺受机器限制区别于常规乳企在线升温无菌灌装工艺，同时也区别于文献报道的一般冷却至发酵温度后接种直接进行发酵的工艺[12−15]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 发酵温度和发酵时长 参考文献[2−3,16]及生产实际对发酵温度因素进行探究，基于1.2.1 所述工艺方法按照复配菌种型号1（嗜热链球菌和德氏乳杆菌乳亚种）和型号2（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌）菌种比例（1:1）制备相应的工业化灌装后但未拉入到温房发酵的系列样品（产品温度为（36±1）℃），其中，复配菌种型号1 较型号2 在5 h 内发酵前期以△pH 计产酸速度相对快的，产黏速度较型号2 是比较慢的（黏度以使用博勒飞旋转粘度计63 号转子在30 r/min、30 s 相同参数条件下测试发酵同等时间的发酵乳样品得到的绝对黏度数据计），分别取30 个样品置于实验室提前预热至37、40、43 ℃的恒温培养箱中，每个发酵温度条件下，每1～1.5 h 随机抽取培养箱3 个位置的发酵乳产品进行酸度滴定，当酸度达到（65±2）°T 时，取出对应产品置于4 ℃冰箱冷藏12 h 后进行成品感官评价。

参考文献[3−4,17]及生产实际对发酵时长因素进行探究，另外，将复配菌种型号1 和型号2 菌种比例（1:1）且工业化在线已升温至40 ℃灌装至塑料杯中的液态奶置于42 ℃电热培养箱中，分别发酵4.5、5.5 和6.5 h 不同时间，再置于4 ℃冰箱冷藏后熟化12 h 后进行综合感官评价。

1.2.2.2 发酵温度波动 生产实际中存在灌装外段推入温房延误导致产品质构不良的情况，故将该因素纳入本研究范围并进行了模拟。将复配菌种型号1和型号2 菌种比例（1:1）且工业化在线已升温至40 ℃灌装至塑料杯中的液态奶置于42 ℃水浴保温5 min 后再分别进行如表1 所示的温度控制，例如，第一组置于10 ℃下保持1 h，然后直接置于42 ℃保持6 h，其他组依次按表格进行从左至右的温度波动模拟实验，然后统计发酵终点酸度和过夜发酵酸度以及产品的不良率。

表1 工业化独立发酵凝固型发酵乳的温度波动实验设计Table 1 Experimental design of temperature fluctuation of industrialized independent fermentation coagulated fermented milk

1.2.2.3 发酵过程剪切破坏 生产实际中存在灌装延误（待装罐中的液态乳轻度发酵）导致轻发酵产品被剪切后再发酵凝固成型后产品质构不良的情况，故将该因素纳入了本研究范围并进行模拟。42 ℃且复配菌种型号1 和型号2 菌种比例（1:1）发酵条件下，以手动上下剧烈摇晃灌装样品10 下（以完成一次上和下的运动合计为1 次，摇晃幅度上下不超过20 cm）来模拟工业化灌装后破坏，摇晃频次为1 次/h，分别摇晃0、1、2、3、4 次，并监控产品过程状态好热滴定发酵过程的产品酸度，同时对发酵酸度达到要求的产品冷藏后熟化12 h 后进行感官评价。

1.2.2.4 菌种比例 参考文献[12,18−19]及生产实际对发酵菌种比例因素进行探究，发酵菌种配比探究实验在小型实验室模拟完成，菌种接种总量为200 DCU/T（2×1013CFU/T），复配菌种型号1 和型号2 菌种比例分别为：1:0、1:1、0:1 DCU/DCU，发酵温度为42 ℃，使用酸化监控仪记录产品的发酵过程酸化曲线，分别采样监控产品过程状态并滴定发酵过程的产品酸度，同时对发酵酸度达到要求的产品冷藏后熟化12 h 后进行感官评价[14−15]。

1.2.3 响应面法试验设计 依据1.2.2 实验结果，参照文献方法[20−22]，按表2 进行三因素三水平响应面法Box-Behnken 设计（BBD）组合试验，包含了20 组，所得数据通过式（1）进行曲面拟合。

表2 工业化独立发酵凝固型发酵乳发酵工艺的BBD因素水平设计Table 2 BBD factor level design of industrialized independent fermentation coagulated fermented milk fermentation process

其中，Y 为响应值，k0～k9均为多项式系数，在实际响应面和等值线图基础上回归分析确立，A、B、C 为独立变量的水平编码值。

1.2.4 酸度、pH 测定 使用万通Eco 电位滴定仪完成对发酵乳的酸度滴定，以pH8.3 判定滴定终点，以吉尔涅尔度（°T）表示，即每100 mL 样品消耗0.1 mol/L NaOH 溶液的毫升数。同时测定pH。

1.2.5 凝固型发酵乳感官评分设计 参考文献[17,23−24]感官评价方法同时结合本研究产品实际情况设计了表3 凝固型发酵乳产品的发酵过程及发酵冷藏后熟化12 h 后的质构风味等感官评分标准，以终产品的综合权重得分作为产品的综合质量评价指标。受过专业训练的感官评价员20 人，统计20 人的平均评分，且不良率以表3 中镜面光滑度5 分以下或冷藏后熟化状态5 分以下进行统计。

表3 凝固型发酵乳产品的感官评分标准Table 3 Sensory scoring standard for coagulated fermented milk products

式中：xi为每一个评价项目的对应得分，wi为每一个评价项目的对应计分权重。

1.2.6 最优条件下的发酵乳特性分析 依据1.2.5的实验结果，制备相应的发酵乳，并对该发酵乳的发酵酸化过程、感官特性及流变学特性进行分析，其中流变学特性参考文献[25−28]采取三段式剪切扫描模式，观察200 s−1高频率剪切破坏后产品黏度和应力恢复情况。

1.3 数据处理

实验分析所用数据是三组平行实验的均值±标准差，采用SPSS 17.0 进行平行数据及组间数据的显著性分析，并利用Origin Pro 2021 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 发酵温度和发酵时长的影响 如图1 所示，结果表明在适宜发酵的温度范围内，温度越高，酸化速度越快，43 ℃发酵温度条件下的酸化速度最快，但表4 结果表明该温度条件下的产品质构、风味却不如40 ℃的。可能原因是发酵剂中的乳酸菌不同温度条件下代谢产生的风味物质（包括乳酸等酸类物质）种类和含量不同，导致pH 降低速度不同，酪蛋白胶束通过等电沉淀的聚合度不同，间接影响风味的释放和保水性（以感官评价中表面乳清析出量作评判）等质构指标，因此，本研究中的发酵剂在43 ℃较高温度条件下，可能代谢产刺激性酸味物质的速度较快，产特征性风味物质醛、醇或酯类不足，同时酸化速度较快，导致酪蛋白胶束提前聚合，在后发酵及冷藏过程中因酪蛋白胶束被打断，聚合度下降，从而使脱水收缩率增加[10,18−19]。因此，38～42℃范围内的发酵温度是本研究需要继续优化的关键因素。

图1 发酵温度和发酵时长对发酵酸度、pH 的影响Fig.1 The influence of fermentation temperature and fermentation time on fermentation acidity and pH

42 ℃分别发酵4.5、5.5 和6.5 h 的综合感官评分情况如表4 所示，结果表明，其综合感官评分从高到低依次为：发酵5.5、6.5 和4.5 h。发酵时间越短，酸奶质构越脆嫩，但保水性差，发酵风味弱；发酵时间越久，发酵乳质构越结实，发酵风味更突出，但不够脆嫩，可能是由于发酵后期复配菌种产生了更多的风味物质和黏性多糖，而酸奶中的黏性多糖和蛋白形成的交联网状结构则越紧密越稳定，表现出来的质构则越结实[29−32]。孙敏等[10]研究也发现添加低聚果糖可以提高低脂凝固型发酵乳的硬度，有利于凝固型酸奶发酵过程中的成型，推测可能是由于低聚果糖的添加会改变低脂凝聚发酵乳的酪蛋白凝胶结构，彼此之间或者和水分子间可以连接在一起，形成重排的酪蛋白凝胶结构。因此4～6 h 范围内的发酵时长是本研究需要继续优化的关键因素。

表4 不同条件下制备的工业化独立发酵凝固型发酵乳的感官评分及不同摇晃次数发酵7 h 的产品酸度Table 4 Sensory scores of industrialized independent fermentation coagulated fermented milk prepared under different conditions and acidity of products fermented for 7 hours with different shaking times

2.1.2 发酵温度波动的影响 如表5 所示，与第6 组无温度波动组别相比，第1 组和第3 组的酸化速度受到显著影响（P<0.05），产品的不良率均显著高于第6 组对照组（P<0.05），该结果表明产品发酵温度波动将显著影响产品酸化速度和产品的不良率。分析原因可能是由于温度的波动影响到了菌种的生长及代谢活力，在非最适宜温度条件下，部分乳酸菌可能处于休眠、生长停滞状态甚至是衰亡等不良状态，还有部分乳酸菌、低温非发酵菌处于弱发酵状态，待恢复到最适宜发酵的温度条件时，总的菌活力明显下降，发酵产物发生变化，导致酸奶质地和风味发生变化[12,18−19]。其中，第1 组的产品不良率相对其他组低，可能是因为10 ℃条件下弱发酵极其微弱，无长时间中温（25～30 ℃）的环境温度过渡，则更利于菌种的复苏和正常发酵，但从10 ℃缓慢升温至42 ℃的发酵过程仍然会对酸奶的凝固状态造成影响。因此，冷灌装再推入温房发酵也无法有效降低产品的不良率，结合生产实际，只能缩短灌装后尾端常温环境中的存放时间，实际温度监测验证显示，尾段存放不超过20 min 推入温房时，产品温度可以保持在36 ℃以上，该措施可有效降低发酵温度波动对产品质构的影响。

表5 发酵温度波动对产品不良率及酸化速度的影响Table 5 The influence of fermentation temperature fluctuation on product defect rate and acidification speed

2.1.3 发酵过程剪切破坏的影响 如表4 所示，在2 h 内发生凝乳现象前进行剪切摇晃破坏，对产品的发酵酸化速度影响不明显，但第3 和4 h 轻度凝乳现象发生后继续剪切摇晃破坏，将显著影响产品质构（P<0.01）、香气（P<0.01）、味道（P<0.05）以及酸化速度（P<0.01）。可能是由于在2 h 内pH 下降幅度不大，酪蛋白胶束也未开始聚合，此时剪切摇晃破坏对发酵体系影响较微弱，而2 h 后，酪蛋白胶束开始缓慢形成，剪切摇晃将对胶束结构形成不可逆的破坏作用，再次形成的酪蛋白胶束的聚合度发生变化，保水性发生变化，因此，工业化在线升温后，若因生产故障等因素2 h 内未及时完成灌装，建议继续发酵为成品酸奶再进行配料使用，超出2 h 的灌装尾段产品也应当进行舍弃，否则易引起产品品质投诉或是产品报废。

2.1.4 菌种比例的影响 如图2 所示，复配菌种型号1 和型号2 菌种比例为（1:1）的酸化速度最快，且表4 结果显示产品发酵质构和风味水平整体最佳。该结果表明单一型号的复配菌种发酵风味比联合型号差，因此优先选择使用联合型号的菌种组别，其中，菌种比例1:1 的综合感官评分为8.50 处于较高水平，故可在此菌种比例基础上作进一步优化。

图2 菌种比例对产品酸化速度的影响Fig.2 The influence of strain ratio on the acidification speed of products

2.2 响应面法设计对产品感官评价得分的影响

依据BBD 模型，评判发酵温度、发酵时长及菌种比例三因素对产品感官评价得分的影响程度，结果如表6 所示。多重回归分析揭示了产品感官评价得分与实验变量之间的关系，可通过如下的表达式进行描述：

表6 基于Box-Behnken 设计的不同因素水平组合下的凝固型发酵乳的综合感官得分Table 6 Comprehensive sensory evaluation of coagulated fermented milk under different factor level combinations based on Box-Behnken design

式中，A、B、C 分别取发酵温度（A）、发酵时长（B）及菌种比例（C）的编码值。

各因素间交互作用对凝固型发酵乳感官评分影响的响应面模型的方差分析结果如表7 所示，P<0.0001，差异极显著，该模型缺少的拟合值的显著性为0.1288（P>0.05），失拟项不显著，这说明缺乏的拟合值并不重要。该模型对应的R2为0.9916，接近于1，表明此模型与真实数据之间具有良好的适用性。由F检验可知影响发酵乳感官品质的主次因素为菌种比例>发酵时长>发酵温度，综上可知，该回归模型较好地定义了该系统中各因素与综合感官得分之间的关系及任意两个变量之间的相互联系。图3 为三维响应曲面和等高线图，如图3A 所示，当菌种比例处于0 这个中间层次时，观察发酵温度和发酵时长之间形成的等高线图，偏离椭圆形状，表明二者的交互作用对产品的综合感官评分没有显著性的影响（P>0.05），同样的现象可在图3B、图3C 中观察到，这表明发酵温度和菌种比例、菌种比例和发酵时长的交互作用对产品的综合感官评分也没有显著的影响（P>0.05），与表7 中的实验结果一致。

图3 各因素间交互作用对凝固型发酵乳感官评分影响的响应面及等高线Fig.3 Response surface and contour lines of the interaction of various factors on the sensory score of coagulated fermented milk

表7 基于Box-Behnken 设计的响应曲面二次模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for quadratic model of response surface based on Box-Behnken design

利用Design Expert 软件计算出工业化独立发酵凝固型发酵乳的最佳工艺参数为：发酵温度42 ℃，发酵时长5.572 h，复配菌种型号1 和型号2 菌种配比0.939，此时感官得分预测值最高为8.288 分。

2.3 最优条件下的凝固型发酵乳的特性

在实际发酵温度42 ℃，发酵时长5.6 h，复配菌种型号1 和型号2 的菌种配比1:1 最优实验室条件下进行了3 次重复实验验证，对应该条件下的发酵酸奶的质构完好率（以酸奶镜面光滑度和冷藏后熟化状态评分均8 分以上进行统计）为100%，发酵乳的综合感官评分为（8.24±0.35）分，与2.1.4 菌种比例1:1 的工业化生产发酵乳样品8.50 分的感官评分接近，同时也与8.288 分预测值接近，证明模型有效，其中，工业化的感官评分更高的原因可能是工业化剪切乳化效果更佳，其酸化曲线如图4 所示，发酵5.6 h时的终点酸度为68.56°T，出冷柜时为70.2°T，可满足国标70°T 的要求。流变学特性曲线如图5，结果显示该发酵乳的抗剪切能力较弱，初始黏度最大为2005000 mPa·s，经过高速剪切后的黏度最高可以恢复至512300 mPa·s，恢复率为25.55%，符合脆软嫩滑形式的凝固型发酵乳的感官特点。工业化生产条件下也完成了3 批次的验证，结果表明，灌装尾段常温环境中暂存20 min 以内随机抽取的30 个样品的产品质构完好率也为100%，感官风味结果与实验室一致。

图4 最优条件下凝固型发酵乳的酸化曲线Fig.4 Acidification curve of coagulated fermented milk under optimal condition

图5 最优条件下凝固型发酵乳的流变学三段式剪切扫描曲线Fig.5 Rheological three-section shear scan curve of coagulated fermented milk under optimal condition

3 结论

本研究基于前人实验室阶段的凝固型发酵乳的探索研究，密切结合生产实际影响因素对工业化发酵乳产品的生产工艺进行了优化处理，确立了最佳工艺条件：在接种发酵2 h 内完成灌装、外段暂存不超过20 min、发酵温度42 ℃，发酵时长5.6 h、复配菌种型号1 和型号2 的菌种配比1:1。最优条件下的发酵酸奶的质构完好率（以酸奶镜面光滑度和冷藏后熟化状态评分均8 分以上进行统计）为100%，发酵乳的综合感官得分为（8.24±0.35）分，发酵5.6 h 时的终点酸度为68.56°T，出冷柜时为70.2°T，可满足国标70°T 要求。产品初始黏度最大为2005000 mPa·s，经过高速剪切后的黏度最高可以恢复至512300 mPa·s，恢复率为25.55%，符合脆软嫩滑形式的凝固型发酵乳的感官特点。其中，单因素实验结果显示灌装后发酵2 h 内剪切破坏影响不大，但超出时间后将严重影响产品质构和酸化速度，灌装后发酵温度波动将显著影响产品酸化速度和产品的不良率，提示工业化发酵过程中应当尽量缩短灌装后段液态乳在常温环境中的暂存时间。响应面法优化分析发酵温度、发酵时长和菌种比例三可控显著性影响因素，结果提示该方法可有效拟合三者之间的关系，可以为工业化生产应用提供科学方法和依据，可以拓展该方法在乳品实际生产中的应用。为工业化生产中不可避免出现的菌种配比称量误差、发酵温度堆热传热波动、人为取样时机导致的发酵时长误差等情况给予了一定的理论指导，方便在实际操作中，快速反应作出相应的对策。另外，200 s−1高剪切后的酸奶黏度恢复率仅为25.55%，符合脆软嫩滑形式的凝固型发酵乳的感官特点，未来可结合流变仪对凝固型发酵乳进行品质控制或是抗运输特性进行深入研究。