热碱法提取制革污泥蛋白质及表征
2022-08-05顾海洋翟世民王冬张丽平付少海
顾海洋，翟世民，王冬，张丽平，付少海,3
(1.江苏省纺织品数字喷墨印花工程技术研究中心，江苏 无锡 214122；2.生态纺织教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡 214122；3.国家先进印染技术创新中心，山东 泰安 271001)
我国作为皮革生产大国，每年皮革产量占全球总产量的23%[1]，每年制革污泥的产量已超过100万 t， 且每年以10%的速度增长[2-4]。制革污泥含有丰富的蛋白质，含量约为20%～40%，对其提取和利用是制革污泥资源化的重要途径之一[5-9]。污泥蛋白质的提取主要有物理法[10-11]、化学法[12-13]、生物法[14-15]和联合处理法[16-18]。本文采用热碱法处理制革污泥，获得蛋白质水解液，通过酸化的方式提取制革污泥蛋白质，并分析其基本性质和安全性。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
制革污泥，河北齐盛皮革有限公司提供，污泥基本性质见表1；氢氧化钠、硫酸、硫酸铵、二苯氨基脲均为分析纯；福林酚，生物级试剂。
表1 制革污泥的基本性质
KH-200水热反应釜；ST3100 pH仪；PMK1602ZH电子天平；L550离心机；DZF-6050真空干燥箱。
1.2 实验方法
制革污泥在运输前经过压滤脱水处理，为了模拟制革污泥脱水前的状态，将制革污泥的含水率调至95%。
1.2.1 制革污泥蛋白质水解液的制备 取100 mL污泥于水热反应釜中，NaOH加入量为9 g/L，充分搅拌，150 ℃加热60 min。待冷却后，测定蛋白质水解液中蛋白质的含量。
1.2.2 制革污泥蛋白的提取 取一定量的污泥蛋白质水解液，用硫酸铵调节pH至7左右，然后加入1.5%(水解液质量)的硅藻土作为吸附剂[19]，在30 ℃下处理2 h。完成吸附后，用1 mol/L H2SO4调节水解液pH至4，在室温下静止1 h，离心、烘干获得污泥蛋白粉末。计算蛋白质提取率(R)。
(1)
式中,Mh为热碱处理后上清液中蛋白质的含量；Ms为制革污泥中蛋白质的含量。
1.3 分析方法
1.3.1 制革污泥蛋白质的含量分析 采用福林酚法测定污泥上清液蛋白质的含量。
1.3.2 制革污泥蛋白质的纯度分析 采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)测定污泥中蛋白质的含量和污泥蛋白粉末的纯度，蛋白质含量计算公式(蛋白质转化系数为6.25)：
蛋白质含量=氮元素重量比(%)×6.25
(2)
1.3.3 制革污泥蛋白质的元素分析 用有机元素分析仪测量制革污泥蛋白质中C、H、O、N元素含量，采用X射线能谱仪(EDS)测量制革污泥蛋白质中其他元素的含量。
1.3.4 制革污泥蛋白质的Cr元素分析 采用IPC-MS测量制革污泥蛋白质中Cr元素的含量；采用二苯碳酰二肼分光光度法(GB/T 1555.4—1995)测量制革污泥蛋白质中Cr6+的含量。
1.3.5 制革污泥蛋白质的氨基酸分析 采用氨基酸高效液相色谱仪测量制革污泥蛋白质中氨基酸的含量。
1.3.6 制革污泥蛋白质的分子量分析 采用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)测量制革污泥蛋白质的分子量分布。
2 结果与讨论
2.1 NaOH用量对制革污泥蛋白质提取率的影响
图1为NaOH用量对蛋白质提取率的影响。
图1 NaOH用量对蛋白质提取率的影响Fig.1 The influence of NaOH dosage on protein extraction rate
由图1可知，蛋白质的提取率随着NaOH用量的增加而增大，NaOH用量为9 g/L时，提取率达到最大值71.2%，NaOH用量超过9 g/L，提取率下降。
2.2 处理时间对制革污泥蛋白质提取率的影响
图2为处理时间对蛋白质提取率的影响。
图2 处理时间对蛋白质提取率的影响Fig.2 The influence of treatment time on protein extraction rate
由图2可知，蛋白质的提取率随着处理时间的延长而增大，处理时间为60 min时，提取率达到最大值70.5%。当处理时间超过60 min时，蛋白质的提取率随之下降。
2.3 处理温度对制革污泥蛋白质提取率的影响
图3为处理温度对蛋白质提取率的影响。
图3 处理温度对蛋白质提取率的影响Fig.3 The influence of temperature on protein extraction rate
由图3可知，蛋白质的提取率随着提取温度的增加而增大，提取温度为150 ℃时，提取率达到最大值71.9%。处理温度过150 ℃时，蛋白质的提取率随之降低。
污泥蛋白质在提取工艺中，存在蛋白质析出溶解和蛋白质分解两种过程[20]。制革污泥中蛋白质主要来源于微生物细胞和皮屑废弃物。在热碱的作用下，污泥微生物细胞破裂，释放蛋白质；皮屑废弃物在碱性环境中降解成蛋白质，液相中的蛋白质浓度增加，此时蛋白质的析出过程占主导。随着NaOH用量、温度、处理时间的增加，在碱性环境下，蛋白质逐渐水解成氨基酸，最终分解成氨氮，此时蛋白质的分解过程占主导，导致蛋白质的提取率下降。因此，NaOH用量、温度、处理时间的增加导致蛋白质提取率先增大后减小。
2.4 响应面实验
根据单因素实验得出的数据，采用Design-Expert 10软件设计响应面实验，分别以处理温度、处理时间、NaOH用量为自变量，以蛋白质提取率为响应值，设计3因素3水平的响应面实验。因素水平见表2，结果见表3。
表2 响应面分析因素及水平
表3 响应面实验结果
蛋白质提取率的回归线性方程为：
蛋白质提取率(%)=-306.99-3.37A+1.84B+16.41C+7.78×10-4AB+2.78×10-4AC-8.33×10-4BC-0.011A2-0.016B2-0.906C2,方差分析见表4。
表4 方差分析结果
由表4可知，模型P值为0.000 2(<0.01)，极为显著；失拟项P值为0.332 3(>0.05)，不显著。说明模型的精确度较高，可以反映各因素对蛋白质提取率的影响关系。图4为响应面3D图。
由图4可知，交互因素中对污泥蛋白提取的影响顺序为：温度×时间>时间×NaOH>温度×NaOH，与方差分析的结果保持一致。
图4 响应面3D图Fig.4 Response surface 3D diagram
根据响应面实验得到蛋白质提取率的二次回归方程，计算预测值和实际值之间的归一化偏差(ND)和归一化标准差(NSD)[21]。
(3)
(4)
式中PR(exp)——实际的蛋白质提取率，%；
PR(pre)——预测的蛋白质提取率，%；
n——实验的次数。
根据模型的预测，污泥蛋白最佳的提取条件：温度148.3 ℃，时间60.3 min，NaOH用量为9.1 g/L，污泥蛋白提取率为72.6%。预测值与单因素实验得出的结果较为接近。蛋白质提取率预测值与实际值的归一化偏差和归一化标准差分别3.8%和1.5%，均低于10%，说明模型准确性较高。
2.5 制革污泥蛋白质分析
将热碱处理后得到的蛋白质水解液pH调节至4，室温静止1 h后得到制革污泥蛋白。
2.5.1 元素分析 制革污泥蛋白为白色粉末状，粗蛋白含量为83.1%，灰分占6.2%，总Cr含量为1.5 mg/kg， 其中Cr6+含量低于检出限，制革污泥蛋白的铬含量符合国家安全标准。表5为制革污泥蛋白的元素组成。
表5 污泥蛋白元素组成
由表5可知，制革污泥蛋白含有Na、Cl、Ca元素表明蛋白质含少量的无机盐。制革污泥蛋白具有较高的纯度，且无机盐的含量较少。图5为制革污泥蛋白的SEM图。
图5 污泥蛋白质在不同倍数下的SEM图片Fig.5 SEM images of sludge protein under different magnificationsa.5 000倍;b.10 000倍
由图5可知，制革污泥蛋白质颗粒较小，颗粒呈不规则的形状。
2.5.2 红外分析 污泥蛋白红外图谱见图6。
图6 制革污泥蛋白FTIR图Fig.6 FTIR image of tannery sludge protein
2.5.3 氨基酸分析 将污泥蛋白在6 mol/L HCl溶液120 ℃水解22 h，分析制革污泥蛋白氨基酸含量，制革污泥蛋白氨基酸组成见表6。
表6 制革污泥蛋白氨基酸组成
由表6可知，污泥蛋白包含常见的14种氨基酸，氨基酸占制革污泥蛋白总量的31.9%，氨基酸含量较高。其中甘氨酸的含量最高为8.59/100， 其次是谷氨酸为3.8/100。
2.5.4 蛋白质分子量分析 温度对蛋白质提取率影响较强，因此分析碱处理温度对蛋白质分子量的影响,结果见图7。
图7 制革污泥蛋白分子量分布Fig.7 Molecular weight distribution of tannery sludge protein
由图7可知，碱处理温度为100 ℃时，污泥蛋白质分子量分布为5～170 kDa，提取温度为150 ℃时，污泥蛋白质分子量分布为5～35 kDa，提取温度为200 ℃时，污泥蛋白质分子量为5～22 kDa。随着提取温度的提升，蛋白质的分子量分布逐渐减小。在碱性环境下，温度提高，加速了蛋白质的水解，大分子蛋白质水解成小分子蛋白质。
3 结论
热碱法提取制革污泥蛋白质的最佳条件：温度150 ℃，时间60 min，NaOH用量为9 g/L，蛋白质的提取率为71.2%。纯度为83.01%，氨基酸含量占31.07%，无机盐含量保持在较低的水平。总Cr含量为1.5 mg/kg，其中Cr6+含量低于检出限，符合国家安全标准(GB 13078—2001)，具有较高的使用价值。
