美拉德反应改性植物蛋白研究进展

郑乾坤，陈复生*，张朵朵，殷丽君

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

近年来，大多消费者基于健康饮食而转向纯素食，因此研究用植物蛋白替代动物蛋白成为了热点[1]。由于蛋白质对pH值、温度和外部压力的敏感性，其结构容易发生变性，从而导致蛋白质的功能特性和营养价值发生改变[2]，因此研究人员选择不同方法改变蛋白质结构或将其与碳水化合物结合来改善蛋白质的功能特性，其中常用方法是热处理、乳化、发酵、水解、酶促和非酶促反应等[3]。在上述方法中，使用美拉德反应对蛋白质进行非酶促糖基化被认为是最有前途的方法之一。因为参与美拉德反应所需的蛋白质和多糖都是绿色、无毒、无污染的，并且美拉德反应是自发进行而不需要添加剂来引发，所以在食品工业中安全性较高[4-7]。

美拉德反应是非酶促反应，在受控条件下，美拉德反应有利于糖基化蛋白质增强功能特性，如热稳定性和溶解性[7]。然而反应程度控制不当时，美拉德反应后期会产生诸多有害物质。通过对温度、时间、pH值及蛋白质和多糖的质量比等条件的控制来阻止美拉德反应进入更高级阶段，防止形成有害成分[8]，将有助于多糖-蛋白复合物在食品工业中的应用以及生产新的增值食品。本文简要概述美拉德反应机理，综述美拉德改性植物蛋白技术以及近年来对传统植物蛋白进行美拉德改性的研究。

1 美拉德改性蛋白质的机理

美拉德反应是一种非酶促反应，其中游离氨基（蛋白质、肽或氨基酸）与游离羰基（还原糖）反应，经历复杂的反应网络和平行的化学转化，形成共轭物和其他美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）。美拉德反应可以分为3个阶段：初级阶段、高级阶段和最终阶段。这些阶段是相互关联的，可以同时发生，并受反应条件的影响。美拉德反应机理见图1[9]。

图1 美拉德反应机理图Fig.1 Maillard reaction mechanism

美拉德反应的初级阶段以初始糖基化反应为特征，主要是还原糖的羰基与氨基酸中的游离氨基之间的缩合反应，水分子释放后形成N-糖基胺，再经过不可逆的重排生成Amadori重排产物。美拉德反应高级阶段始于Amadori重排产物的降解，这取决于体系的条件，如pH值、时间和温度。当pH值等于或低于7时，生成糠醛或羟甲基糠醛。当pH值高于7时，生成还原酮及各种裂解产物，包括缩醛、丙酮醛和双乙酰。这些裂解产物具有很高的活性，并参与新的反应。最终阶段仍有一系列的反应发生，包括环化、脱水、逆醛化、重排、异构化和缩合，还会形成棕色的含氮聚合物和共聚物，称为类黑精[9-10]。与早期阶段相比，美拉德反应的高级和最终阶段包含高度的复杂性。

2 美拉德改性蛋白质的技术研究进展

传统的美拉德反应改性蛋白质方法有干热法和湿热法。然而对植物来源的蛋白质来说，由于紧密的蛋白质结构阻碍了活性氨基与糖的羰基反应，导致美拉德反应速率较慢[11]。因此，许多学者将研究重点放在不同的辅助技术上，如超声波处理、静电纺丝和微波等辅助技术，这些辅助技术可以打开蛋白质的紧密结构、加快美拉德反应速率、提升美拉德反应的结合效果。这些辅助技术有其自身的优势和局限性，它们可以显著改善蛋白质的功能特性，也可以影响美拉德反应的初始阶段，减少晚期美拉德反应终产物的形成。因此有必要进行研究，以了解它们对多糖-蛋白质共轭物的结构、功能和生物活性的影响。

2.1 超声波辅助技术

超声波由频率超过20 kHz的声波组成，在液体中可以产生空化气泡，空化气泡内爆产生高能量，介质中的粒子在超声波的作用下产生剧烈振动，引起介质间相互作用，从而引起蛋白质结构发生改变。超声波对美拉德反应的影响见图2[9]。

图2 超声波对美拉德反应的影响Fig.2 Effect of ultrasound on Maillard reaction

如图2所示，超声波辅助技术能大幅度提高处理速度、效率和质量，主要应用于改变蛋白质的功能性质，例如乳化、结构和其他功能属性[12]。

葛伟[13]的研究表明，酪蛋白-葡萄糖的糖基化反应程度随着超声时间的延长先增加后减小，在20 min时反应程度最大。随着超声功率的增加，反应程度随之增大，并在450 W时达到最大。Zhao等[14]研究超声波预处理对大豆蛋白-葡萄糖/麦芽糖共轭物的物理化学特性和流变学特性的影响，与未经处理的样品相比，超声波预处理会使共轭物糖基化程度增加、褐变强度降低、颗粒大小和三级结构的展开增加。Cui等[15]研究经超声预处理制备的大豆分离蛋白-葡萄糖共轭物对分子柔韧性和乳化性能的影响。结果表明，随着超声强度的增加，反应速率明显增加。预处理后，由于粒径减小和结构疏松，形成的共轭物柔韧性显著增加，这与共轭物的乳化能力增强有关。Mu等[16]使用超声波辅助预处理将大豆分离蛋白与阿拉伯树胶接枝，发现使用超声波辅助预处理进行美拉德改性所需的时间为60 min，远低于传统方法所需的48 h。经过预处理后大豆分离蛋白的α-螺旋和β-折叠明显减少，二级结构无序卷曲增加。可以看出，采用超声波辅助美拉德反应，可以使蛋白质结构展开，缩短美拉德反应的时间，增加美拉德反应的程度，同时共轭物的功能特性得到改善。但过度超声处理也会导致晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs） 等有害物质的形成，这可能会阻碍超声波的潜在应用。因此，必须平衡预处理以避免形成晚期糖基化产物，同时提高结合率。

2.2 微波辅助技术

与其他的美拉德改性辅助技术相比，微波辅助美拉德改性反应条件更温和，共轭效率也更稳定[17]。微波辅助改善蛋白质功能性质的原理主要体现在微波辅助处理时，极性基团吸收微波，产生自由基，改变蛋白质的二级和三级结构，从而影响蛋白质的乳化和溶解性[18]。

毕伟伟等[19]的研究发现微波对酪蛋白糖基化的反应程度和速率随着微波功率和微波时间的增大逐渐增加，但是在微波功率达到500 W、微波时间20 min时，接枝度达到最大。Guan等[20]利用微波加热研究大豆蛋白与低聚糖（乳糖、麦芽糖、葡聚糖和可溶性淀粉）的接枝反应，研究表明：微波加热处理后，美拉德反应速率分别是传统加热的6、7、57、12倍。这意味着微波加热与传统加热相比显示出类似的共价键结合，但需要更低的活化能，因此可以有效地避免AGEs的形成。Cheng等[21]研究微波处理对大米蛋白和葡聚糖之间美拉德反应的影响，研究发现微波预处理提高了糖基化速率，溶解度明显增加，微波加热5 min内溶解度增加64%，而常规加热5 min内溶解度增加24%。以上研究表明，与传统加热相比，微波辅助得到的共轭物功能和生物活性得到了改善，证明了微波辅助美拉德改性的优势。

2.3 静电纺丝辅助技术

静电纺丝是一种静电纤维制造技术，可将生物分子构造成纤维[22]。静电纺丝原理图及其对美拉德共轭物的影响见图3[23]。

图3 静电纺丝原理图及其对美拉德共轭物的影响Fig.3 Schematic diagram of electrospinning and its effect on Maillard conjugate

如图3所示，静电纺丝由于其拉伸和弯曲运动导致生物分子结构重新排列，而生物分子结构由于聚合物链缠结而变得完整，主要影响因素有溶液黏度、多糖浓度、纤维大小、蛋白质与多糖的混合比、温度和湿度的影响。通过静电纺丝辅助美拉德改性，反应时间缩短，糖化程度增强，蛋白质构象发生变化，复合物生成量增加[24]。

与传统的干法或湿法加热方法相比，利用静电纺丝辅助制备的豌豆蛋白-麦芽糊精基共轭物[25-27]的不同功能性质有所改善。改变电纺多糖纤维中羰基含量可以调节糖基化程度。共轭物的溶解度从34%增加到44%，这与疏水性蛋白质与亲水性碳水化合物的结合有关，也增加了形成共轭物氢键的能力。静电纺丝辅助美拉德共轭技术已用于成膜，学者研究了静电纺丝明胶-葡萄糖[28]和玉米醇溶蛋白/明胶纤维-葡萄糖[29]美拉德共轭对润湿性、机械性能和生物相容性的影响。结果表明，弹性模量和生物相容性得到提高，所得膜具有可调的润湿性和非细胞毒性。静电纺丝技术作为预处理的方式促进美拉德结合物的生成，以及在植物蛋白质溶解度提升方面，在蛋白质修饰中的潜力较大。

2.4 高压辅助技术

在高压加工中，待加工的产品浸没在充满液体（水、硅油、苯甲酸钠、乙醇、乙二醇、蓖麻油等）的压力容器系统中，液体充当压力传递介质，蛋白质基于压力会导致构象转变、体积变化和多糖无定形和结晶区域的重排以及水的侵入[30]。Moreno等[31]研究高压处理对大豆分离蛋白7S和11S球蛋白乳化活性和稳定性的影响。由于高压处理会使蛋白质单体的部分或全部变性，增强表面活性，这些蛋白质在不同压力下表现出更好的表面疏水性、乳液稳定性和活性。Moreno等[31]进行了基于葡萄糖-赖氨酸-美拉德反应的模型系统研究，压力为400 MPa，pH值范围为5～10，发现压力处理并不会影响Amadori重排产物的形成，但由于压力诱导的酸解离（pH＜8）导致中晚期MRP的形成受到显著抑制。而在pH值为10.2时，高压加速了中期和晚期阶段的AGEs形成。

戊糖苷是美拉德反应过程中形成的蛋白质结合荧光标记物之一，是确定美拉德反应阶段和强度的指标。Schwarzenbolz等[32]研究美拉德反应期间高静水压对戊糖苷形成的影响，在高达600 MPa的压力下测试了由N-乙酰精氨酸、N-乙酰赖氨酸和核糖组成的溶液，发现Amadori重排产物的降解因高压处理而减少，结果表明高压处理有助于控制MRP的形成并阻止晚期糖基化。

2.5 脉冲电场辅助技术

脉冲电场技术（pulsed electric field，PEF）是将短脉冲电施加于两个电极之间的电场技术，应用于食品工业的脉冲电场强度一般为0.1 kV/cm～80.0 kV/cm。PEF处理导致美拉德结合物的功能特性发生实质性变化，游离氨基酸含量增加，并抑制蛋白质的热诱导聚集[33]。PEF处理可对多糖和蛋白质结构产生显著影响，从而对糖基化的速率、效率和热性能产生积极影响[34]。

基于天冬酰胺-葡萄糖[35]、天冬酰胺-果糖[36]和甘氨酸-葡萄糖[37]美拉德模型系统，学者研究了PEF对美拉德反应的影响。在28 kV/cm的场强下，反应速率和MRP形成相比明显增加。陈刚等[38]研究了脉冲电场对于不同还原糖-谷氨酸钠溶液的pH值、中间产物、褐变、还原糖含量以及抗氧化活性的影响，当脉冲电场处理条件为场强4 kV/cm，时间1.88 ms，得到的果糖-甘氨酸钠体系在294 nm和420 nm处的吸光度从0分别增加到1.71和0.07，同时，抗氧化活性增加10.96%，果糖含量减少55%，表明脉冲电场对于果糖-谷氨酸钠体系的美拉德反应有明显影响。

3 美拉德反应改性植物蛋白研究现状

植物蛋白具有能提供高营养价值、低过敏性、易获得性和较低成本等优势，经修饰后可以赋予蛋白不同的功能，在食品加工业中备受关注[39]。大豆蛋白是最受欢迎的植物蛋白之一，在工业生产中所占比重大以及成本较低。大豆蛋白由大豆球蛋白（＞70%）和β-伴大

豆球蛋白组成，与单糖或双糖（葡萄糖[15]、麦芽糖/葡萄糖[14，40]、核糖[41]、果糖[42]）和多糖（香豆胶[43]、葡聚糖[44-45]、阿拉伯树胶[46]、麦芽糖糊精[47-48]）结合，使用传统或改进的糖基化技术对其改性，并进行理化性质和功能性分析。美拉德共轭物对乳液稳定性、溶解性、热稳定性和表面疏水性等功能性质有明显影响。与其他植物蛋白质相比，豌豆蛋白的乳化能力、表面电荷和溶解度较低，但其过敏性和成本也低，所以用阿拉伯树胶[24]、果胶[39]和麦芽糖糊精[49]通过美拉德反应对豌豆蛋白质进行结构修饰以提高其乳化活性。花生蛋白与其他豆科蛋白质（大豆除外）相比表现出更好的功能特性，但因溶解度太低而未能充分利用。使用葡聚糖通过美拉德改性可以改善花生蛋白的功能性质[7]，通过超声辅助美拉德反应可以克服花生蛋白糖基化难的问题[50-52]。超声波使蛋白质结构展开，增加亲水性氨基酸残基的暴露，溶解性提高从而使糖基化效率明显提高。表1列出了多种植物蛋白通过美拉德反应与碳水化合物复合的研究现状。

表1 近年来不同植物蛋白通过美拉德改性研究内容Table 1 Research contents of Maillard modification of different plant proteins in recent years

4 结语

美拉德反应显示出修饰植物源性蛋白质的潜力，但其传统的反应方法所需周期长，效果不显著。为了改善传统反应方法的缺点，各种新颖的预处理技术相继出现。这些预处理技术在辅助美拉德改性植物蛋白方面效果明显，但多数研究是使用单一糖或蛋白质模型系统进行，而食品是复杂体系，因此还需要进行更深层次的系统性研究。目前通过美拉德反应修饰植物蛋白主要集中在传统植物蛋白，而对于一些非传统的植物源蛋白还缺乏研究。植物蛋白的美拉德改性在食品工业中显示出巨大的应用潜力，因此进一步对改性后的蛋白质-多糖复合物进行功能性和生理活性研究，将有助于提高植物蛋白的应用价值，也有助于开发植物源功能性食品。