响应面法优化竹笋笋头中黄酮、甾醇和三萜类化合物的联合提取

谭志梅，王晨戍，王淑培，张静，杭方学*，张炜盛

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530004；2.南宁师范大学 环境与生命科学学院，南宁 530001；3.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300)

竹笋(bamboo shoot)是禾本科亚竹科植物的嫩苗，食用部分为竹初生的芽和嫩茎[1]。我国竹林资源丰富，种植的竹笋包括毛竹笋、麻竹笋等30多种[2]。竹笋含多糖、蛋白质、膳食纤维、多酚等多种营养物质[3]，此外，有研究表明，竹笋对高血压、冠心病、糖尿病等疾病有一定的预防作用。现今，我国虽为竹笋生产、加工和销售大国，但竹笋深加工产品少，资源利用率低。以毛竹笋为例，可食用部分仅占30%，而废弃的笋头和笋壳占50%～70%[4]，这部分加工副产物利用率低，从而造成竹笋原料的浪费及环境污染。近年来，为综合利用竹笋资源，科研人员对竹笋加工废弃资源(笋壳、笋头、笋渣)的营养价值和综合利用进行了大量研究，主要有将其开发为饲料、纺织纤维、功能性食品以及提取其中的功能活性物质，如多糖、甾醇、酚类等[5-9]。黄酮、甾醇、三萜类化合物作为竹笋废弃物中的活性成分，具有多种生理功能，如黄酮具有抗菌、抗炎、降血脂、抗氧化等作用[10-12]；甾醇能抗炎、抗癌、延缓衰老等，被广泛应用于食品和保健品行业[13-14]；三萜类化合物能抗炎、抗肿瘤和毒细胞、提高免疫调节[15-16]。对于这3种活性物质，常见的提取方法有溶剂提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法等[17-18]，但联合提取研究较少，其中，超声辅助提取以成本低、提取时间短、提取效率高的优点被广泛研究和应用。本研究旨在对竹笋笋头中黄酮、甾醇和三萜类化合物进行联合提取并优化其提取工艺，以期为竹笋笋头资源的综合开发及利用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

竹笋笋头：由福建三信食品有限公司提供。

1.2 试剂

芦丁、混合植物甾醇、齐墩果酸：均为对照标准品；石油醚(30～60 ℃)、氯仿、冰醋酸、高氯酸(AR)：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇：三圆化学试剂有限公司；亚硝酸钠、乙酸酐、硫酸(AR)：西陇化工股份有限公司；硝酸铝、氢氧化钠(AR)：上海展云化工有限公司。

1.3 主要仪器与设备

KQ-300E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；数显恒温水浴锅 常州中捷实验仪器制造有限公司；电子天平 奥豪斯仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；DHZ-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；V-1100D可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；PW80超微粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；RE52-99旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.4 试验方法

1.4.1 标准曲线的绘制

参考王俊青等[19]的方法进行芦丁标准曲线的绘制，用于黄酮提取得率的计算。以溶液在λ=510 nm处的吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。试验所得标准曲线方程为y=9.2366x+0.0665，R2=0.9997；参考项发晖等[20]的方法绘制甾醇标准曲线，以吸光度为纵坐标，甾醇标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性关系式为y=1.117x+0.0053，R2=0.9993；参考曾慧慧等[21]的方法绘制齐墩果酸标准曲线，用于三萜类化合物得率的计算，得标准线性方程为y=65.875x-0.032，R2=0.9991。

1.4.2 样品的制备及含量的测定

将竹笋头晒干烘干后粉碎，过60目筛备用。准确称量2.0 g样品粉末于250 mL平底烧瓶中，加入一定体积的乙醇溶液，置于已加热至预定温度的超声波清洗仪中进行浸提。提取时间结束后趁热抽滤，冷却后用20 mL石油醚萃取3次，完成后分装于50 mL刻度试管中，原溶剂定容后摇匀。乙醇相溶液取1，0.2 mL，石油醚相取20 mL于试管中，蒸干溶剂分别作为黄酮、三萜类、甾醇样品。

根据标准曲线绘制方法处理样品并测定吸光度。以样品吸光度对照标准曲线得到样品中黄酮、甾醇和三萜类化合物的浓度(mg/mL)。得率计算方法：得率(mg/g)=(样品浓度×样液体积×稀释倍数)/样品质量。

1.4.3 单因素试验设计

以黄酮、甾醇、三萜类化合物的提取得率为考察指标，以乙醇浓度、料液比、超声提取时间、提取温度作为主要影响因素，对各个因素选取5个不同水平(乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%；料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30；提取时间10，20，30，40，50 min；提取温度40，50，60，70，80 ℃)进行单因素试验。

1.4.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果，采用Design-Expert V8.0.6.1 软件，采用Box-Behnken试验设计，以黄酮、甾醇、三萜类化合物的提取得率为响应因子，对乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度4个因素进行四因素三水平的响应面优化试验，进一步寻求联合提取的最优条件。试验的因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.4.5 数据处理与分析

运用Excel 2019统计所有数据，数据分析采用SPSS 20软件。方差分析采用ANOVA分析，采用Duncan's多重比较进行差异显著性分析。图表绘制采用Origin 9.0软件。正交试验设计及分析使用Design-Expert V8.0.6.1软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对提取得率的影响

乙醇浓度对黄酮、甾醇和三萜提取得率的影响见图1。

图1 乙醇浓度对提取得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield

由图1可知，黄酮和三萜的得率随着乙醇浓度的升高呈先升高而后下降的趋势，分别在80%、70%取得最高得率，甾醇得率随着乙醇浓度的增加而增加，在乙醇浓度达80%后上升变缓。这可能是由于黄酮、甾醇、三萜类化合物都是羟基化合物，它们会与笋头中的一些营养成分如蛋白质、多糖等由氢键连接，随着乙醇浓度的增加，氢键遭到破坏，使得提取物溶出率增加，当浓度继续增大，高浓度溶剂会使蛋白质变性，阻碍化合物溶出[22]。溶剂的极性也会影响物质的提取，随着乙醇浓度的增加，溶剂极性改变，在适宜的溶剂极性条件时提取效果最佳，超过适宜浓度时，提取得率可能下降[23]。综合3种物质的提取得率，选择联合提取的乙醇浓度为80%。

2.1.2 料液比对提取得率的影响

在提取温度70 ℃、提取时间30 min、乙醇浓度70%的条件下，考察不同料液比对提取得率的影响。由图2可知，目标产物的提取得率在料液比为1∶10～1∶30范围内呈先上升快后趋于平缓的变化过程。原因可能是整个提取过程是一种传质过程，随着溶剂量的增加，稀释了溶液中黄酮、甾醇和三萜的质量浓度，使得固液相间化合物浓度差增大，增加了提取过程中的传质动力[24]。此外，溶剂的增加使得浓度减小，传质阻力减小，利于提取。当料液比超过适宜范围后，其他杂质的溶出增加，对目标产物的溶出形成竞争性抑制[25]。因此，考虑到实际提取效果以及原料的消耗，选取联合提取的料液比为1∶25。

图2 料液比对提取得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield

2.1.3 提取时间对提取得率的影响

由图3可知，黄酮、甾醇和三萜的得率在提取时间为10～30 min范围内随着时间的增加而上升，超过30 min之后黄酮和甾醇的得率变化不大，而三萜的得率明显下降。原因可能是物质的提取需要一定时间才能充分溶出，在提取时间为30 min之前，随着提取时间的增加，笋头样品与乙醇溶液接触得更充分，目标产物的溶出率增加，当提取时间继续增长时，溶剂中目标产物的浓度上升，浓度差减小，以至达到平衡便不会再溶出[26]。而三萜类化合物在提取时间达到30 min以后提取得率明显下降，可能是由于超声时间过长，溶液长时间处于70 ℃的高温下，破坏了已溶出的三萜类物质的结构，从而导致得率下降[27]。因此，选取提取时间为30 min。

图3 提取时间对提取得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield

2.1.4 提取温度对提取得率的影响

提取温度对提取得率的影响见图4。

由图4可知，黄酮得率在温度为40～80 ℃范围内先上升后趋于稳定，甾醇和三萜得率都呈现出先上升后下降的趋势，甾醇下降更明显。当温度升高时，分子热运动增加，植物细胞壁破裂，提取得率明显提升[28]，温度持续升高到超过70 ℃以后，使得乙醇缓慢挥发，浓度降低，还可能导致目标产物的分解，致使产物的得率有所下降[29]，因此，选择提取温度为70 ℃。

图4 提取温度对提取得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield

2.2 响应面法优化试验设计及结果分析

在单因素试验基础上，利用响应面设计软件Design-Expert V8.0.6.1中的Box-Behnken设计，以黄酮得率、甾醇得率和三萜得率为试验因子进行了27个提取试验，试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 The response surface experimental design and results mg/g

对表2中试验数据进行二次多项回归拟合，得到黄酮得率、甾醇得率和三萜得率与各因素变量的二次方程模型，该模型的方差分析结果见表3～表5。

Y黄酮得率= 4.64-0.18A+0.37B+0.62C+0.47D-0.081AB+0.000AC+0.040AD+0.18BC+0.15BD+ 0.12CD-0.26A2-0.28B2-0.58C2-0.37D2。

Y甾醇得率=3.98+0.59A+0.077B+0.091C-0.20D-0.13AB-0.011AC+0.017AD+8.500E-003BC+0.14BD+5.500E-003CD-0.43A2-0.20B2-0.10C2-0.25D2。

Y三萜得率=9.20-0.15A+0.42B+0.39C+0.016D-0.028AB+0.095AC+0.000AD+0.057BC-0.057BD-0.085CD+0.026A2-0.53B2-0.61C2-0.28D2。

表3 黄酮得率的回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of the yield of flavonoids

表4 甾醇得率的回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of the yield of sterols

表5 三萜得率的回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model of the yield of triterpenoids

由表3～表5可知，建立的笋头黄酮、甾醇、三萜提取模型的P值均<0.0001，模型极显著，失拟项不显著，回归模型的RAdj2分别为0.9614，0.9502，0.9061，表明建立的模型拟合度良好，试验误差小，可用于笋头中3种化合物提取得率的预测和分析。黄酮提取试验中一次项和二次项均为极显著，交互项中BC、BD的交互作用显著，由F值可知，4个因素的影响顺序为：提取时间(C)>提取温度(D)>料液比(B)>乙醇浓度(A)；在甾醇提取试验中，一次项A、D极显著，B、C显著；二次项A2、B2、D2极显著，C2显著；交互项AB、BD显著，4个因素的影响顺序为：乙醇浓度(A)>提取温度(D)>提取时间(C)>料液比(B)；三萜提取试验中一次项A、B、C极显著，二次项B2、C2、D2均为极显著，交互项均不显著，各因素的影响顺序为：料液比(B)>提取时间(C)>乙醇浓度(A)>提取温度(D)。

2.3 验证试验

通过回归模型预测出的最佳提取工艺参数为乙醇浓度82.46%，料液比1∶27.24，提取时间34.74 min，提取温度71.84 ℃，在此提取条件下黄酮、甾醇和三萜得率分别是4.97，4.07，9.29 mg/g。考虑到实际操作情况，调整最佳工艺条件为乙醇浓度83%，料液比1∶28，提取时间35 min，提取温度72 ℃，在此条件下经过3次平行验证试验，得出黄酮得率是4.88 mg/g；甾醇得率是3.98 mg/g；三萜得率是9.25 mg/g。验证试验结果与模型理论值相近，说明该模型能够较好地用于黄酮、甾醇和三萜联合提取工艺参数的优化。

3 结论

本研究以竹笋加工废弃物的笋头为试验原料，在单因素试验结果的基础上通过响应面试验对竹笋笋头中黄酮、甾醇、三萜的联合提取工艺条件进行了优化，得出最优的联合提取工艺参数为乙醇浓度83%，料液比1∶28，提取时间35 min，提取温度72 ℃。在此条件下黄酮得率是4.88 mg/g，甾醇得率是3.98 mg/g，三萜得率是9.25 mg/g。与预测值的相对误差分别为0.026%、0.022%、0.004%，表明试验建立的回归模型能有效预测3种活性物质的提取率。该试验工艺为开发竹笋加工副产物，从而提高竹笋产业经济效益提供了一定的理论依据。