一测多评法测定姜汁红糖中的6种姜辣素类成分含量

陈其钊，陈红香*，陈嘉敏，王桂华，李家威，余构彬

(1.广东省科学院生物工程研究所，广州 510316；2.国家糖业质量监督检验中心，广州 510316)

姜汁红糖是以红糖为原料，添加姜汁、姜粉加工而成的食糖[1]。中医营养学认为，性温的红糖通过“温而补之，温而通之，温而散之”[2-3]来发挥补血作用，生姜则具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳、解毒的功效，常用于风寒感冒、脾胃寒症、胃寒呕吐、肺寒咳嗽、解鱼蟹毒[4]。民间素有“男子不可百日无姜，女子不可百日无糖”[5-6]之说。用生姜、红糖熬制的姜汤可活血驱寒，防治感冒，自古就是风寒感冒时的食疗良药。

目前市面上有关姜汁红糖的产品非常多，但是并没有相关产品的国家标准。轻工业标准QB/T 5006-2016虽然规定了姜汁红糖的各项指标，但并不具有强制性，市面上几乎所有的产品都是执行GB/T 29602-2013[7]《固体饮料》或者自己的企标。以至于我们在前期调查中发现，各家产品在生姜的添加量上参差不齐。

姜汁红糖中的主要成分为蔗糖和姜辣素。常见的姜辣素成分有6种，目前2020版《中国药典》只规定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚作为生姜质量评价的指标成分，并不够全面。GB/T 22293—2008[8]中利用校正因子法测定了6种成分，但是其中的峰定位十分模糊，分离不理想，干扰大，耐用性等也不明确。

然而目前尚未见将姜醇和姜酚主要活性成分共同作为姜汁红糖质量评价指标的文献报道。故本研究建立一测多评法同时分析了不同产品的姜醇和姜酚含量，拟将生姜主要特征性活性成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚共同作为其质量控制指标成分，更加全面地评价姜汁红糖的质量，便于企业、机构执行利用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

Aglient 1260、1260II高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；VORTEX 3涡旋混合器 艾卡(广州)仪器设备有限公司；CL5R医用离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Milli-Q超纯水系统 默克密理博公司；色谱柱 Ecosil C18-Eco100A C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 广州绿百草生物科技有限公司；Mycotox C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) Pickering公司；ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 安捷伦公司；中谱红RD-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm) 中谱科技公司。

1.2 试剂

甲醇、乙腈(色谱纯)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；冰乙酸、甲酸、磷酸(分析纯)：广州化学试剂有限公司。

标准物质：6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚(纯度≥98%)：成都普菲德生物技术有限公司；合成辣椒素(纯度99.5%)：上海安谱实验科技股份有限公司。

9批次姜汁红糖样品均购于大型超市,见表1。在分析之前，所有食糖样品都储存在塑料罐中阴凉避光保存。

表1 姜汁红糖样品来源Table 1 The source of brown sugar ginger juice samples

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ecosil C18-Eco100A C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；检测波长：280 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；流动相：(A)1%冰乙酸、(B)乙腈，梯度洗脱：0～15.0 min，52.0% A；15.0～17.0 min，52.0% A→40.0% A；17.0～43.0 min，40.0% A→20.0% A；43.0～43.01 min，20.0% A→52.0% A；43.01～50.0 min，52.0% A。

2.2 供试品溶液的制备

准确称量1.00 g姜糖用适量甲醇溶解，涡旋1 min后超声30 min，用甲醇定容到10 mL。摇匀，以0.22 μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

2.3 标准溶液的制备

标准储备液：分别精密称取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚及合成辣椒素标准品各10 mg，用甲醇溶解后分别定容至100 mL，即得各标准品浓度为100 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存。

标准工作溶液：从各标准储备液中分别取适量混合，涡旋混匀，用甲醇稀释成浓度为2～50 mg/L的混合标准品溶液，以作线性范围考察及含量测定使用。

2.4 阴性对照溶液

使用不含生姜的红糖作为阴性对照样品，再按照2.2的方法制成对应的阴性对照溶液。

2.5 色谱条件优化

2.5.1 提取方法选择

6种姜辣素成分可溶于无水乙醇和甲醇，同时避免样品中蔗糖含量太高的干扰。但是无水乙醇的截止波长较高，作为溶剂时，基线漂移较大，而甲醇作为提取溶剂基线相对平滑。由于姜辣素是热不稳定的酚类化合物，在较高温度下容易受到破坏而损失，若考虑姜辣素的品质和提取率，则超声波辅助法为最佳提取方法[9-10]。姜汁红糖中除了蔗糖、姜辣素外，还有色素[11-12]、甾醇[13-14]、黄酮多酚类[15-17]、有机酸[18]等。本研究中考虑到回收率并未选择净化方法，因此需要较长的梯度洗脱来实现分离、排除干扰。

2.5.2 流动相选择

以2020版《中国药典》以及国家标准(见表2)为参考，本实验分别尝试了1%乙酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-甲醇+乙腈(1+1)、甲醇-水、乙腈-水作为流动相，发现在乙腈+酸水条件下，能实现7种成分的分离。在甲醇-水和乙腈-水作为流动相时，7种成分会出现峰形拖尾或重叠的情况。而在甲醇-酸水系统下，完全出峰时间则超过60 min，显得过长。所以，选择1%乙酸-乙腈作为流动相。

表2 药典及标准中姜辣素的研究情况Table 2 Study on gingerols in pharmacopoeia and standard

2.5.3 检测波长选择

在190～400 nm波长下分别对7种成分标准溶液进行紫外扫描，发现在230 nm和280 nm处均有较强吸收，但是经过测试，在230 nm处各成分响应一般，280 nm处响应高，杂质也相对较少。所以，选择280 nm作为检测波长。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察

混合标准品溶液与姜汁红糖提取液的色谱图见图2。通过比对，鉴别出姜汁红糖中6种姜辣素成分，峰位见图2标注，各定量峰分离良好，无明显干扰。

2.6.2 线性与范围

精密吸取混合对照品储备液一定体积，按倍数关系稀释成不同质量浓度的标准溶液进行测定，采用优化后的前处理方法以及色谱条件，以7种成分色谱峰的峰面积平均值(Y)为纵坐标，对应的标准溶液浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线；以信噪比S/N=3确定仪器检出限(LOD)，结果见表3。

表3 7种成分的标准曲线、线性范围及检出限Table 3 Standard curves, linear ranges and detection limitsof 7 components

7种成分在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；6-姜酚检出限为5.56 mg/kg，8-姜酚为8.77 mg/kg，10-姜酚为7.81 mg/kg，6-姜烯酚为7.11 mg/kg，8-姜烯酚为9.43 mg/kg，10-姜烯酚为8.57 mg/kg，合成辣椒素为8.33 mg/kg。该方法灵敏度较高，可满足糖品中姜辣素检测的需要。

2.6.3 仪器精密度实验

取混合对照品溶液按照2.1的方法，在色谱条件下连续进样8次，结果见表4。6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚、合成辣椒素峰面积的RSD分别为1.40%、0.71%、0.92%、2.30%、1.80%、0.71%、0.72%，表明仪器的精密度良好。

表4 仪器精密度试验结果Table 4 Precision test results of instruments

2.6.4 稳定性试验

按照2.2的样品处理方法制备空白加标(5 mg/L)1份，冷藏条件(2～4 ℃)下放置，分别于0，1，3，6，9，12，24 h取出，按照2.1的方法考察其稳定性。结果表明，在冷藏条件下放置24 h更稳定，见表5。

表5 24 h稳定性试验结果(2～4 ℃下避光放置)Table 5 24 h stability test results (place away from light at 2～4 ℃)

2.6.5 回收率试验

精确称取红糖样品1.00 g，分别加入3个水平的对照品，在最佳提取条件及色谱条件下，每一浓度平行3次测定红糖中姜辣素的回收率，结果见表6。红糖中6-姜酚的平均回收率为95.8%～104.4%，8-姜酚的平均回收率为89.8%～103.0%，6-姜烯酚的平均回收率为88.2%～102.2%，10-姜酚的平均回收率为94.6%～105.3%，8-姜烯酚的平均回收率为130.0%～134.3%，10-姜烯酚的平均回收率为80.9%～90.8%。

表6 回收率试验结果(0 ℃下避光放置)Table 6 Recovery rate test results (place away from light at 0 ℃)

2.7 校正因子的计算

精密吸取2.3项下制备的系列标准溶液适量，依法进样测定各成分的峰面积，以合成辣椒素为参照物，计算其他6种成分的相对校正因子k/s，公式为k/s=k/s=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为参照物含量，As为参照物峰面积，结果见表7。

表 7 姜汁红糖中7种成分相对校正因子Table 7 Relative correction factors of 7 components in brown sugar ginger juice

2.8 不同仪器、不同色谱柱对校正因子的影响

对比考察3台高效液相色谱仪及4种色谱柱对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚校正因子的影响，结果显示6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚校正因子的RSD分别为1.64%、3.53%、3.83%、3.89%、6.05%、4.51%，表明不同仪器、不同色谱柱对校正因子影响较小，结果见表8。

表8 不同仪器、 不同色谱柱对校正因子的影响Table 8 Effect of different instruments and chromatographic columns on correction factors

2.9 不同流速的耐用性验证

取混合对照品溶液进样，按照2.1的方法，分别考察流速为0.7，1.0，1.5 mL/min下，以合成辣椒素作为参照成分时其他6种成分的相对校正因子，考察流速波动对相对校正因子的影响。结果表明各相对校正因子RSD在0.66%～4.58%，说明相对校正因子在流速波动变化0.7～1.5 mL/min范围内耐用性良好，结果见表9。

表9 不同流速对相对校正因子的影响Table 9 Effect of different flow rates on relative correction factors

2.10 不同柱温的耐用性验证

取混合对照品溶液进样，按照2.1的方法，分别考察柱温为30，35，40 ℃下，以合成辣椒素作为参照成分时其他6种成分的相对校正因子，考察柱温对相对校正因子的影响。结果表明各相对校正因子RSD在0.09%～8.85%，说明相对校正因子在柱温波动变化5 ℃范围内耐用性良好，结果见表10。

表10 不同柱温对相对校正因子的影响Table 10 Effect of different column temperatures on relative correction factors

2.11 不同pH值的耐用性验证

取混合对照品溶液进样，按照2.1的方法，分别考察流动相pH值分别为1.5，2.6，3.5，以合成辣椒素作为参照成分时其他6种成分的相对校正因子，考察流动相pH值对相对校正因子的影响。结果表明各相对校正因子RSD在0.25%～5.13%，说明相对校正因子在不同pH值溶液中适应性良好，结果见表11。

表11 流动相pH值对相对校正因子的影响Table 11 Effect of mobile phase pH values on relative correction factors

2.12 待测成分色谱峰的定位

本文以合成辣椒素为内标色谱峰，考察3台高效液相色谱仪及4种色谱柱条件下，待测成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚色谱峰的相对保留时间值， 结果显示6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚相对保留时间值的RSD分别为0.97%、3.46%、4.30%、2.25%、4.83%和3.78%，表明不同仪器、不同色谱柱对相对保留时间值无显著影响，结果见表12。

表12 不同仪器、不同色谱柱对相对保留时间值的影响Table 12 Effect of different instruments and chromatographic columns on relative retention time value

续 表

2.13 QAMS法与外标法测定结果的比较

取表1中的姜汁红糖样品，按照2.2的方法，每个样品平行制备3份供试品溶液，分别采用一测多评法和外标法测定姜汁红糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的含量，结果见表13。采用SPSS 25软件，对外标法与QAMS法测得的结果进行配对t检验，结果显示P>0.05，表明两种方法测定值之间无显著差异。

表13 含量测定结果(n=3，g/100 g)Table 13 Results of content determination (n=3,g/100 g)

3 结论

本研究以合成辣椒素为参照物，建立了姜汁红糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的QAMS定量方法。该方法精密度、稳定性、重复性及耐用性较好，均符合分析要求。采用该方法检测了9批姜汁红糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的含量，t检验分析结果显示：该方法与外标法得到的含量值基本一致，说明以合成辣椒素为参照物的QAMS法可准确对6种姜辣素成分进行定量测定。本研究结果可为姜汁红糖的质量控制与质量评价提供新思路和参考。