发酵食品风味物质形成及前处理方法研究进展

黄一承，仲美桥，韩妍，李丹，李晓磊

(长春大学农产品加工吉林省普通高等学校重点实验室，长春 130022)

传统发酵食品是通过微生物作用而形成的食品。目前我国人民生活水平日益提高，人们对发酵食品的品质也有了新的要求，在发酵食品的营养价值及风味等方面的需求不断提升。发酵食品可以根据原料不同分为发酵谷类食品、发酵豆类食品、发酵蔬菜、发酵乳制品、发酵肉制品以及其他发酵制品，含有丰富的功能成分，如酱油、腐乳等发酵豆类食品含有大豆多肽、大豆异黄酮等成分，能有效促进肠胃运动，降低胆固醇[1]。发酵食品因为发酵方式的特点，往往具有独特的风味，风味是食品品质的评价指标之一，能够影响消费者对食品的接受度，因此对于发酵食品的风味研究越来越成为研究的热点。

对食品风味物质的分析包括前处理、定性定量分析以及贡献率的分析等。针对食品中复杂多样的挥发性化合物，气相色谱是一种传统的分析方法，其凭借不同挥发性化合物在色谱柱中的保留时间不同而对化合物进行分离，但是定性分析往往只能依据组分的保留特征，不能快速准确定性化合物。近年来，气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS)联用技术和气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry， GC-IMS)联用技术成为分析食品风味物质的常用方法，能够有效地分离复杂的挥发性风味物质并进行定性和定量分析，这些技术现已广泛应用于食品、工业、农业、医学等领域中[2-5]。本文将对气相色谱联用技术的原理、风味物质前处理方法及其在发酵食品风味方面的应用进行归纳总结，同时对其不足及发展方向进行讨论，为发酵食品风味的研究提供理论依据。

1 发酵食品风味研究

发酵食品是将原料在微生物作用下通过固态发酵、液态发酵或自然发酵[6-7]制得的，在发酵过程中通过一系列反应生成和消耗各种化合物，从而改变食品的营养及风味[8]。除了营养功效外，发酵食品受消费者欢迎的原因还有其独特的风味。原料、发酵环境、微生物种类和发酵时间等因素导致不同发酵食品具有不同的风味，为探究特色风味的形成原因并改良发酵工艺，国内外研究人员进行了大量风味研究，见表1。微生物在食品发酵过程中起重要作用，食品发酵常用的微生物包括乳酸菌、酵母菌、霉菌等，不同微生物的代谢方式及产物存在差异。

表1 风味形成影响因素研究Table 1 Study on the influencing factors of flavor formation

1.1 发酵菌株对发酵食品风味的影响

1.1.1 乳酸菌对发酵食品风味的影响

乳酸菌是发酵食品常用的发酵菌株之一，包括植物乳杆菌、戊糖片球菌、双歧杆菌等，是发酵食品中酸类物质和醇类物质含量变化的重要原因，对改变产品风味、产生氨基酸和酚类物质、提高产品的营养价值具有积极意义[9]。

梁红敏等[10]通过副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌制作葡萄酵素，结果表明4种乳杆菌均能提高酵素的总酚含量和抗氧化能力，其中干酪乳杆菌的产酸能力最强。

1.1.2 酵母菌对发酵食品风味的影响

发酵中常见的酵母菌有酿酒酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母等。酵母菌与发酵食品的醇类、酯类及有机酸物质的生成密切相关，其中酵母菌在酒精发酵阶段起重要作用，能够将原料中的葡萄糖转换成乙醇和二氧化碳，并在这个过程中产生大量醇类和酯类副产物，构成了丰富的产品风味[11]。

Liu等[12]通过酿酒酵母及4种非酿酒酵母(葡萄有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、耐热克鲁维酵母和德尔布有孢圆酵母)发酵黄桃酒，揭示了不同非酿酒酵母菌株的特征代谢产物，其中葡萄有孢汉逊酵母对乙酸乙酯的产量提升最大，耐热克鲁维酵母能够降低可滴定酸度并提升苯乙醇含量。

1.1.3 霉菌对发酵食品风味的影响

霉菌主要包括根霉、曲霉、毛霉、青霉等。酱油、醋等采用固态发酵的产品离不开制曲的过程，曲中往往存在大量的霉菌，在制曲过程中及发酵的初期起重要作用。霉菌在发酵过程中能够产生淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等，蛋白酶等物质能够将蛋白质原料分解成氨基酸等营养且具有风味的物质。淀粉酶等物质能够将淀粉类原料分解成小分子糖，增加营养价值并为其他微生物提供更适宜的条件，从而进一步产生大量风味物质。

王巧云[13]通过毛霉和根霉发酵腐乳，发现在毛霉、根霉以及混合发酵下，腐乳的总酸及氨基酸含量增加，此外，混合发酵的腐乳具有更好的抗氧化活性。

1.2 其他发酵条件对发酵食品风味的影响

除了发酵菌株外，发酵原料、发酵时间和发酵环境(温度、pH、盐度等)也是发酵食品风味形成的重要贡献者。发酵原料的不同会改变发酵起始化合物含量，发酵环境和发酵时间会影响微生物的发酵效果，从而改变发酵食品的最终风味。在对固定产品风味形成的优化研究中，国内外研究人员往往从这些方面入手进行工艺优化。

He等[14]研究不同温度下发酵酸菜的挥发性化合物含量，结果表明随着发酵温度的升高，挥发性化合物种类增加，且不同发酵温度下发酵产品中作用的微生物种类存在差异。

2 风味测定方法

2.1 GC-MS及GC-IMS技术简述

GC-MS与GC-IMS是风味研究中常用的仪器，GC-MS与GC-IMS原理及特点见表2。目前食品风味的研究已成为国内外研究的热点[15-16]，Web of Science 检索结果显示GC-MS仍然是食品风味研究的主要方法，但从2019年开始，通过GC-IMS对食品风味进行研究的文章数量快速攀升，2020年与2021年涨幅分别达到了250%和132%。

表2 GC-MS与GC-IMS原理及特点Table 2 Principles and characteristics of GC-MS and GC-IMS

2.2 食品风味物质提取方法

测定食品风味成分往往需要对样品进行前处理，目前常用的前处理方法包括液液萃取、同时蒸馏萃取、溶剂辅助风味蒸发、固相萃取、固相微萃取、搅拌棒吸附萃取、薄膜固相微萃取等(见表3)。前处理方法的选择与样品物理化学性质密切相关，蒸馏或顶空(HS)技术适合处理高挥发性化合物，使用液液萃取和固相萃取方法必须考虑样品的溶解度，使用固相萃取、固相微萃取、搅拌棒吸附萃取和薄膜固相微萃取需要考虑样品的极性[19]。

表3 样品前处理方法原理及特点Table 3 Principles and characteristics of sample pretreatment methods

2.2.1 液液萃取

液液萃取(LLE)是通过分析物在水样与有机溶剂之间的溶解度差异来萃取分析物，通常使用二氯甲烷、乙醚、正戊烷和正己烷等萃取能力高的溶剂或其中几种的混合物。LLE具有许多优点。例如萃取范围较为广泛，能够萃取具有不同挥发性和极性的化合物。但是它还具有多种缺点，例如需求的溶剂量较大，另外，液液萃取相较其他方法步骤多、耗时长，且溶剂的选择取决于要萃取的化合物。

2.2.2 同时蒸馏萃取

同时蒸馏萃取(SDE)也是通过溶剂萃取的原理来实现的，与LLE相比，SDE是通过加热将样品中的挥发性物质与萃取溶剂蒸汽混合达到萃取的目的，因此SDE能够有效防止非挥发性成分对结果的干扰。但是，长时间的加热可能会破坏挥发性物质的结构。

2.2.3 溶剂辅助风味蒸发

溶剂辅助风味蒸发(SAFE)是在水或有机溶剂辅助下提高真空度，从而使挥发性化合物与非挥发性化合物分离。SAFE萃取过程中不需要升温，因此对化合物结构破坏较小，萃取出的化合物更接近样品。但是SAFE也存在缺点，例如操作过程相对复杂且对易挥发化合物萃取效果不佳。

2.2.4 固相萃取

固相萃取(SPE)是通过吸附剂的选择性保留化合物，随后用一种对分析物亲和力强于吸附剂的溶剂进行洗脱得到所需化合物。因此溶剂的极性十分重要，极性过高或过低均会导致萃取效果降低。与LLE相比，SPE减少了有机溶剂的体积、耗时短，并且能够有效避免分析物分解。尽管如此，SPE也有一些缺点，如继续使用有机溶剂。

2.2.5 固相微萃取

固相微萃取(SPME)是通过涂有吸收性聚合物材料(固定相)的熔融石英纤维来实现的。SPME能够用于气态、水甚至固体样品。分析物在样品和固定相之间存在分配平衡，因此可以将部分样品吸附在固定相上，并在进样口解吸。

SPME纤维可以通过两种不同的方式引入到样品中:直接浸入或顶空。直接浸入是将光纤直接浸入液体样品中，比顶空更灵敏，更适合萃取液体样品中的挥发性和半挥发性化合物，但纤维的寿命较短。顶空是将光纤暴露在气态样品或固液样品上方的蒸汽中，纤维的寿命比DI-SPME更长，因为它不与样品接触。HS-SPME比DI-SPME更适合于萃取气态、水溶液和固体样品中的高挥发性化合物。

与其他更传统的前处理技术相比，固相微萃取技术的主要优点是：简单和快速，样品量小，不需要有机溶剂或较高的处理温度，更便宜，可以提高检测限，萃取和浓缩相结合且可用于固体、液体和气体样品。固相微萃取的优点以及成熟的技术令它成为目前最为常用的一种前处理方法，见表4。

表4 前处理方法在测定发酵食品中挥发性化合物方面的应用Table 4 Application of pretreatment methods in the determination of volatile compounds in fermented food

2.2.6 搅拌棒吸附萃取

搅拌棒吸附萃取(SBSE)是将一个封装在涂有吸收材料的玻璃中的磁棒放入含有样品的小瓶中来吸收所需的化合物，之后再进行解吸。SBSE与SPME的原理相似，因此在溶剂使用、速度、简易程度等方面，与SPME的优点相同。但SBSE比SPME的灵敏度高50～250倍且允许测定更多的样品量，这是因为SBSE采用搅拌棒替代了萃取纤维，吸收材料体积显著增大。SBSE也有一些局限性，例如，搅拌棒不能直接在进样器中解吸，此外，目前SBSE可用的吸收材料还在不断研究，而且对自动化的研究较少。

2.2.7 薄膜固相微萃取

薄膜固相微萃取(TF-SPME)是由覆盖有吸收材料的碳膜组成。TF-SPME与SPME、SBSE一样，也可以采用顶空或浸入的方式。它能够有效解决SPME和SBSE存在的一些缺点，例如，它比SPME具有更大的表面积和固定相体积，因此更敏感且吸收量更大。另一方面，TF-SPME的膜由多种吸收剂组成，通常是二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)，而SBSE的吸收材料往往采用PDMS，因此TF-SPME比SBSE能够分析更多种类的化合物。这是一种较为新颖并在不断发展的技术，因此目前采用TF-SPME结合GC分析酵食品的研究还比较少。

2.2.8 衍生化

有机酸、糖类等非挥发性化合物对样品的口感及气味也存在影响及修饰作用，因此对发酵食品中非挥发性化合物的测定也是一个研究方向。衍生化是通过GC测定非挥发性化合物的一个常用前处理方法，能够增加高沸点化合物的挥发性并修饰峰形，主要包括硅烷化反应、酯化反应、醚化反应、酰化反应等。各种衍生化方法的对象及常用试剂见表5。

表5 衍生化方法对象及常用试剂Table 5 Objects and common reagents of derivatization methods

3 展望

GC-MS和GC-IMS已被广泛应用于食品行业，且随着基础理论的不断丰富，使用这些技术对发酵食品风味成分进行分析已成为发展趋势，国内外研究人员通过该技术已对各种发酵食品的风味物质进行了测定，为推动食品发酵行业发展提供了强有力的支持。但是，气相色谱技术在发酵食品的风味研究上还有一些缺陷和不足，未来气相色谱技术在发酵食品分析上的应用可以从以下两个方面进行深入研究：首先，发酵食品种类众多，样品前处理方法尤为重要，为了能够更好、更全面地分析样品中物质，应对前处理条件进行不断优化以及考虑前处理方法的结合；其次，食品发酵是一个复杂的过程，可以通过气相色谱等仪器测定的指标对其中的条件和机制进行更深入的研究。