雷公藤内酯醇通过CHOP/BCL-2内质网应激途径诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡*

徐成波， 郑瑞玑， 廖 斌， 齐 彦， 沈建箴

（1福建省人民医院，福建中医药大学附属人民医院血液科，福建 福州 350004；2福建医科大学附属漳州市医院血液科，福建 漳州 363000；3福建医科大学附属协和医院血液科，福建 福州 350001）

雷公藤内酯醇（triptolide，TPL）是从传统中药雷公藤根皮中分离出的含环氧二萜内酯化合物（分子式为C20H24O6），既往临床研究发现其具有显著的抗炎、抗肿瘤和免疫调节等药理作用［1-3］。实验研究显示，TPL 对多发性骨髓瘤（mutiple myeloma）等多种血液系统肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡的抗肿瘤作用［4-6］，其机制主要是通过细胞周期阻滞，调控核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、BCL-2 家族表达［7-8］以及逆转表观遗传学修饰［9-14］等途径诱导肿瘤细胞凋亡。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是由于细胞基因或外环境等因素改变而导致细胞内质网功能受损，从而引起细胞内发生一系列病理生理反应的过程。研究发现ERS 反应是促进肿瘤细胞凋亡的重要通路之一［14］。本研究以人多发性骨髓瘤RPMI8226 细胞为研究对象，观察TPL对RPMI8226 细胞活力、凋亡及ERS 反应中CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）/BCL-2 途径的影响，并探讨二者之间的相互关系，以期阐明TPL 通过ERS途径诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的作用机制。

材料和方法

1 细胞株

多发性骨髓瘤RPMI8226 细胞株为福建省血液病研究所冻存细胞株（ATCC编号：CCL-155），在本院中心实验室经常规复苏后传代培养并保存。

2 主要试剂和仪器

雷公藤内酯醇由福建医科大学药学院提供；MTT 试剂为 Sigma 产品；胎牛血清、PRMI-1640 培养液购自Gibco；Annexin V FITC/PI 凋亡试剂盒为南京凯基生物公司产品；SYBR Advantage qPCR Premix 为TaKaRa 产 品 ；Lipofectamine 2000 购 自 Invitrogen；CHOP siRNA 购于广州锐博生物科技有限公司；CHOP 和BCL-2抗体为Abcam 产品；引物由上海Invitrogen 合成。超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；细胞培养箱购自中国力康公司；倒置相差显微镜为Nikon 产品；流式细胞仪为Becton Dickinson产品；酶标仪为MD 产品；荧光定量PCR 仪为Thermo产品；蛋白电泳仪为Bio-Rad产品。

3 主要方法

3.1 雷公藤内酯醇药液的配制 实验前以1 g/L 的丙二醇进行雷公藤内酯醇母液配制，经微孔滤膜除菌后，4 ℃避光保存备用，使用时以培养液将母液稀释至所需浓度。

3.2 细胞培养和实验分组 细胞常规复苏后，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液进行传代培养，培养条件为37 ℃、饱和湿度、浓度为5%的CO2培养箱，细胞生长倍增后，每间隔24～48 h 换液1 次。根据雷公藤内酯醇药物终浓度不同，将细胞分为不同浓度（40、80 和160 nmol/L）的雷公藤内酯醇作用组，以及不加药的空白对照（control）组。在CHOP siRNA 转染干预实验中，分别设不加药的空白对照（control）组、80 nmol/L 的雷公藤内酯醇药物作用组（TPL 组）、80 nmol/L 的雷公藤内酯醇联合CHOP siRNA 转染组（TPL+CHOP siRNA 组）及80 nmol/L 的雷公藤内酯醇联合阴性siRNA 的转染对照组（TPL+CHOP NC 组）。不同药物浓度作用组同时设3 个相同浓度的复孔。

3.3 MTT 法检测细胞活力 将RPMI8226细胞密度调整为2×108/L 并接种于96 孔板中。加入不同浓度（40、80 和160 nmol/L）的雷公藤内酯醇作用不同时间（24、48 和 72 h）后，每孔中加入5 g/L 的 MTT 试剂20 μL 后培养4 h，再加入二甲基亚枫100 μL。在酶标仪上检测570 nm 波长下各孔的吸光度，计算细胞的相对活力。

3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 按凋亡试剂盒说明书，将不同浓度（40、80 和160 nmol/L）的雷公藤内酯醇作用于RPMI8226细胞或转染后的RPMI8226细胞48 h 悬液进行离心沉淀，去除上清液后加入1×binding buffer 并调整细胞密度至（2～5）×108/L。每份细胞悬液中加入195 μL 缓冲液和5 μL FIFC-annexin V，混匀后避光孵育10 min 再次离心并去除上清液。最后每份细胞中加入190 μL 缓冲液和10 μL碘化丙啶，混匀后避光孵育10 min，1 h 内上机检测细胞凋亡率。

3.5 CHOP siRNA 的细胞转染 根据siRNA 使用说明书，将体外合成的CHOP siRNA 冻干粉，配制成20 μmol/L 的溶液。取 5 μL CHOP siRNA 与等体积的Lipofectamine 2000 混匀后室温孵育20 min。将CHOP siRNA-Lipofectamine 2000 混合液溶于 490 μL的不含血清的RPMI-1640 培养液中，室温孵育后转染至RPMI8226 细胞中继续培养48 h 后检测相关指标。

3.6 RT-qPCR 检测 CHOP 和 BCL-2 的 mRNA 表达水平 Trizol 法提取各实验组细胞RNA 并反转录合成cDNA。应用SYBR Advantage qPCR Premix 试剂盒进行RT-qPCR 扩增。CHOP 的上游引物序列为5'-AGCTGAGTCTCTGCCTTTCG-3'，下游引物序列为5'-TGTGGTCTCTACCTCCCTGG-3'；BCL-2 的上游引物序列为5'-GGGGCTACGAGTGGGATGC-3'，下游引物序列为5'-GGGTAGCGGCGGGAGAAGT-3'。总反应体系为 25 μL，其中 SYBR Advantage qPCR Premix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，加去离子水至25 μL。PCR 条件为：95 ℃ 6 min；95℃ 5 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，40 个循环。以GAPDH 为内参照，2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

3.7 Western blot 检测 CHOP 和 BCL-2 的蛋白表达水平 细胞裂解法提取各实验细胞总蛋白。取40 μg 蛋白进行上样，进行12%的SDS-PAGE，并电转膜1.5 h 后加入脱脂奶粉封闭醋酸纤维膜2 h，分别与CHOP、BCL-2 及GAPDH 鼠Ⅰ抗 4 ℃孵育过夜，洗膜后再与鼠Ⅱ抗孵育1 h，加入化学发光试剂后在暗室曝光、照相及采用软件提取图像分析。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。实验重复3次，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 雷公藤内酯醇对RPMI8226细胞活力的影响

MTT 结果显示，不同浓度（40、80 和160 nmol/L）的TPL 作用于 RPMI8226 细胞不同时间（24、48 和 72 h），各TPL 浓度组的细胞活力随药物浓度的升高和作用时间的延长呈逐渐降低的趋势，各TPL 浓度组的细胞活力与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图 1。这一结果提示，TPL 能够抑制RPMI8226 细胞活力，且随TPL 浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用越显著。

Figure 1. The changes of RPMI8226 cell activity after treatment with different concentrations of TPL for different time. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 nmol/L TPL（24 h）group；#P＜0.05 vs 0 nmol/L TPL（48 h）group；△P＜0.05 vs 0 nmol/L TPL（72 h）group.图1 不同浓度雷公藤内酯醇作用不同时间后RPMI8226细胞活力的变化

2 雷公藤内酯醇对RPMI8226细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，不同浓度（40、80 和160 nmol/L）的 TPL 作用于 RPMI8226 细胞 48 h 后，各浓度组细胞的凋亡率依次为（13.93±2.80）%、（28.74±2.60）%和（43.47±1.59）%，空白对照组为（1.99±0.30）%，各TPL 浓度组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各组间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见图2。这一结果表明，TPL 能够诱导RPMI8226 细胞凋亡，且随TPL 浓度的增加，细胞的凋亡率逐渐升高。

Figure 2. The changes of RPMI8226 cell apoptosis rate after treatment with different concentrations of TPL for 48 h. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 nmol/L group.图2 不同浓度雷公藤内酯醇作用48 h后RPMI8226细胞凋亡率的变化

3 雷公藤内酯醇对RPMI8226 细胞CHOP mRNA和蛋白表达水平的影响

RT-qPCR 结果显示，不同浓度（40、80 和 160 nmol/L）的 TPL 作用于 RPMI8226 细胞 48 h 后，各浓度组细胞CHOP 的mRNA 表达水平分别是2.61±0.37、6.67±0.53 和 7.62±0.43，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各组间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见图3A。Western blot 结果显示，各TPL浓度组细胞CHOP的蛋白表达水平分别为2.61±0.41、6.09±0.19 和7.81±0.31，空白对照组为0.76±0.13，各TPL 浓度组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各组间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见图3B。以上结果表明，TPL可以诱导 RPMI8226 细胞中 CHOP 的表达，且 CHOP 表达水平随TPL浓度的升高而增强。

4 雷公藤内酯醇对BCL-2 mRNA 和蛋白表达水平的影响

RT-qPCR 结果显示，不同浓度（40、80 和 160 nmol/L）的 TPL 作用于 RPMI8226 细胞 48 h 后，各 TPL浓度组细胞BCL-2 的mRNA 表达水平分别是0.59±0.02、0.48±0.32 和 0.35±0.04，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各组间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见图4A。Western blot 结果显示，各TPL 浓度组细胞BCL-2 的蛋白表达水平分别0.18±0.02、0.11±0.02 和0.05±0.01，空白对照组为0.82±0.04，各TPL 浓度组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各组间比较差异亦有统计学意义（P＜0.05），见图4B。以上结果表明，TPL可以抑制RPMI8226 细胞中BCL-2 的表达，其表达水平随TPL浓度的升高而降低。

5 CHOP siRNA 转染后CHOP mRNA 和蛋白表达水平的变化

RT-qPCR 结 果 显 示 ，将 CHOP siRNA 转 染RPMI8226 细胞后，CHOP 的 mRNA 表达水平在 TPL组、TPL+CHOP NC 组和 TPL+CHOP siRNA 组中分别为 5.50±0.23、5.87±0.21 和 1.51±0.05，TPL+CHOP siRNA 组与TPL+CHOP NC 组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图5A。Western blot 结果显示，TPL组、TPL+CHOP NC 组和 TPL+CHOP siRNA 组 CHOP的蛋白表达水平分别为 1.68±0.04、1.72±0.05 和0.69±0.03，TPL+CHOP siRNA 组与 TPL+CHOP NC组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图5B。

Figure 3. The changes of CHOP mRNA（A）and protein（B）expression after treatment with different concentrations of TPL for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 nmol/L group.图3 不同浓度雷公藤内酯醇作用48 h后CHOP mRNA和蛋白表达水平的变化

6 CHOP siRNA 转染RPMI8226 细胞后雷公藤内酯醇对细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，将CHOP siRNA 转染RPMI8226 细胞后，CHOP表达被沉默，TPL 组、TPL+CHOP NC 组和 TPL+CHOP siRNA 组 RPMI8226 细 胞的凋亡率分别是（29.33±1.87）%、（30.67±1.24）%和（14.43±0.98）% ，TPL+CHOP siRNA 组 与 TPL+CHOP NC 组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。这一结果提示，TPL 诱导RPMI8226 细胞凋亡与CHOP的表达水平密切相关。

7 CHOP siRNA 转染RPMI8226 细胞后雷公藤内酯醇对BCL-2 mRNA和蛋白表达水平的影响

RT-qPCR 结 果 显 示 ，将 CHOP siRNA 转 染RPMI8226 细胞后，TPL 组、TPL+CHOP NC 组和 TPL+CHOP siRNA 组 BCL-2 的 mRNA 表 达 水 平 分 别 为0.38±0.03、0.37±0.01 和 0.77±0.03，TPL+CHOP siRNA 组与TPL+CHOP NC 组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图7A。Western blot 结果显示，TPL组、TPL+CHOP NC 组、TPL+CHOP siRNA 组 BCL-2 的蛋 白 表 达 水 平 分 别 为 0.04±0.03、0.03±0.01 和0.20±0.03，TPL+CHOP siRNA 组与 TPL+CHOP NC组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图7B。这一结果表明，TPL 通过启动 ERS 反应，调控 CHOP 下游BCL-2凋亡信号诱导RPMI8226细胞凋亡。

讨 论

多发性骨髓瘤是恶性浆细胞增殖性肿瘤，由于其致病机制不明确且缺乏有效的治疗手段，导致其治疗效果仍不理想。尽管单克隆抗体、蛋白酶体抑制剂以及新型免疫调节剂等药物的广泛应用，目前临床上多发性骨髓瘤治疗的总体有效率有所提高，但至今仍被认为是不可治愈的恶性血液病，因此开发具有高效低毒的抗多发性骨髓瘤药物具有广阔的应用前景。

Figure 4. The changes of BCL-2 mRNA（A）and protein（B）expression after treatment with different concentrations of TPL for 48 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 nmol/L group.图4 不同浓度雷公藤内酯醇作用48 h后BCL-2 mRNA和蛋白表达水平的变化

Figure 5. The changes of CHOP mRNA（A）and protein（B）expression after CHOP siRNA transfection. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs TPL+CHOP NC group.图5 CHOP siRNA转染后CHOP mRNA和蛋白表达水平的变化

Figure 6. The changes of apoptosis rate after CHOP siRNA transfection. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs TPL+CHOP NC group.图6 CHOP siRNA转染后RPMI8226细胞凋亡率的变化

TPL 是从卫矛科植物雷公藤的根皮中分离出的生物活性成份，作为一种传统中药，临床上主要应用于自身免疫性疾病的治疗。本课题组前期研究［12-13］和本次实验研究均发现，雷公藤内酯醇可以显著的抑制RPMI8226 的增殖并诱导凋亡。实验研究发现TPL 具有显著的抗肿瘤的作用，其机制是通过直接抑制肿瘤细胞的增殖，或激活caspase 家族通路，抑制NF-κB 的表达，或是通过细胞周期阻滞和逆转肿瘤抑制基因的甲基化诱导肿瘤细胞凋亡。

内质网是广泛存在于真核细胞中的细胞器，是蛋白质合成、折叠和运输的主要场所，对细胞应激反应、蛋白质合成、折叠和运输具有重要调节作用［15］。在病理生理状态下，由于外界环境的变化可使细胞内质网生理功能发生紊乱导致ERS 的发生，ERS 对细胞增殖和凋亡有重要的决定作用，严重而持续的ERS 可直接导致细胞凋亡的发生。研究还发现当外界信号启动ERS 途径，发生由ERS 所介导的凋亡信号通路时，通过激活下游的凋亡信号，如BCL-2 家族和caspase 家族等可以诱导肿瘤细胞凋亡。转录因子CHOP 作为ERS 诱导凋亡信号通路的关键分子，是CCAAT 增强子结合蛋白家族的一员，该家族属于碱性区亮氨酸拉链蛋白家族，在细胞增殖分化、周期调控、免疫应答、炎症反应、肿瘤发生及凋亡等过程中发挥作用。在正常生理状态下细胞中CHOP 低表达，但在ERS 状态下表达显著升高，它阻断细胞增殖及通过调节其下游基因包括DOCs和caspase-1 等诱导内质网相关的细胞凋亡，也可通过抑制抗凋亡基因bcl-2和上调促凋亡基因bax表达水平介导细胞凋亡，是ERS 发生的重要标志［16］。研究证实当肿瘤细胞发生ERS 时会导致CHOP 的活化，表达上调的CHOP 蛋白通过抑制 BCL-2 水平，诱发 caspase 分子级联反应，从而导致肿瘤细胞凋亡［17-18］。

本研究发现，不同浓度的TPL 作用于RPMI8226细胞48 h后，随着药物浓度的升高，细胞的增殖活力逐渐降低，细胞凋亡率逐渐升高，细胞中CHOP 的mRNA 和蛋白表达水平逐渐增强，表明TPL 在诱导RPMI8226 细胞凋亡的过程中，可促进ERS 途径的关键分子CHOP 表达上调，即TPL 具有激活RPMI8226细胞中ERS 途径的作用。与此同时，TPL 作用RPMI8226细胞48 h后BCL-2的mRNA 和蛋白表达随药物浓度的增加而表达减弱，表明在TPL 作用下能够启动BCL-2抗凋亡信号介导RPMI8226细胞凋亡。

Figure 7. The changes of BCL-2 mRNA（A）and protein（B）expression after CHOP siRNA transfection. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs TPL+CHOP NC group.图7 CHOP siRNA转染后BCL-2的mRNA和蛋白表达水平的变化

基于上述实验结果，本研究应用RNA 干扰技术降低RPMI8226 细胞中CHOP 的表达，沉默ERS 途径的“分子开关”CHOP基因，在 CHOP siRNA 转染联合TPL 作用后的 RPMI8226 细胞中，CHOP 的 mRNA 表达水平被抑制，而细胞的凋亡率明显下降，结果提示TPL诱导RPMI8226细胞凋亡的作用与CHOP的表达密切相关。与此同时，在TPL联合CHOP siRNA 转染的细胞中BCL-2 表达水平较转染对照组明显上调，提示BCL-2抗凋亡信号的启动受CHOP基因的调控。因此，本研究结果表明TPL 可通过激活RPMI8226 细胞发生ERS反应，上调ERS途径下游关键分子CHOP表达，抑制BCL-2 抗凋亡信号，从而诱导RPMI8226细胞凋亡。

综上所述，本研究初步证实TPL 是一种具有显著抗多发性骨髓瘤细胞活力并诱导凋亡的有效成份，CHOP/BCL-2内质网应激途径是介导该作用的可能分子机制之一。