柚皮素通过调控Nrf2-GPX4介导的铁死亡途径保护脑出血大鼠*

黎玉环， 熊光润， 郑 力， 李 敏， 郑永强

（宜昌市第二人民医院神经内科，湖北 宜昌 443008）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种破坏性神经损伤，占所有中风的10%～15%，具有高发病率和高死亡率等特点［1］。由于缺乏有效的治疗选择，ICH 患者的预后较差［2］。血脑屏障（blood brain barrier，BBB）损伤、脑水肿和炎症反应是导致神经功能障碍，造成不良预后的主要原因［1］。在大脑中，ICH 会导致各种类型的神经元死亡，包括铁死亡［3］。铁死亡是一种受调节的非凋亡性细胞死亡形式，由铁依赖性脂质过氧化积累引起。据报道，铁死亡有助于ICH 引起的脑损伤，并且可能是ICH 后有影响的细胞死亡类型之一［4］。因此，靶向抑制铁死亡的治疗可有效预防神经元死亡。

核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是一种重要的铁死亡抑制剂，激活Nrf2 可通过直接上调谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的转录来保护细胞免受铁死亡［5］。据报道，在 ICH 后，脑内 GPX4 水平逐渐降低，24 h 达到最低水平，而GPX4 水平升高可缓解ICH 后脑水肿、BBB 损伤、神经元功能障碍、氧化应激和炎症［6］。因此，用特异性抑制剂抑制铁死亡或上调GPX4 可能是减轻ICH 引起的脑损伤的潜在策略。柚皮素（naringenin，NAR）是一种天然抗氧化剂，属于黄酮类化合物，因可以激活Nrf2而被认为是一种神经保护剂［7］。NAR 可以通过激活神经元中的Nrf2 信号通路，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平以减轻氧化应激［8］。有资料显示，NAR可通过调节Nrf2/GPX4 轴抑制铁死亡进而减轻心肌缺血/再灌注损伤［9］。然而，NAR 是否能抑制 ICH 中的铁死亡还未见相关报道。

材料和方法

1 动物

SPF 级雄性 SD 大鼠 94 只，7～8 周龄，体质量（280±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号为SCXK（鲁）2019-0003。饲养在湿度为45%～55%、温度为20～23 ℃的环境中，并保持12 h 的明暗循环，自由获取水和食物。

2 主要试剂与仪器

NAR（纯度≥95%）购自Sigma-Aldrich；Nrf2 特异性抑制剂ML385 购自MedChemExpress；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（WST-1 法）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（TBA 法）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（微板法）均购自南京建成生物工程研究所；Fluoro-Jade C（FJC）退化神经元染色试剂盒购自艾美捷科技有限公司；亚铁离子（Fe2+）含量检测试剂盒（比色法）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；二氢乙啶（dihydroethidium，DHE；超氧化物阴离子荧光探针）及兔源Nrf2、GPX4、溶质载体家族7 成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）、lamin B1 和 GAPDH 抗 体 购 自 Thermo Fisher Scientific。DB006-1型数显脑立体定位仪（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司）；iMark680 多功能酶标仪（Bio-Rad）；Axio Scope A1荧光显微镜（Zeiss）。

3 主要方法

3.1 模型制备、分组及给药 采用脑内注射自体血液的方法建立ICH 模型［1］：用戊巴比妥钠（45 mg/kg）通过腹腔注射麻醉大鼠，并用加热垫使动物体温维持在37 ℃；然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，暴露前囱，在前囱后1 mm，向右旁开3.8 mm 处用颅骨钻钻一直径为1 mm的小孔（深度达硬脑膜）；将26号针立体定向插入右侧纹状体（坐标：前0.1 mm、腹侧5.5 mm 和前囟外侧 3.8 mm），于 10 min 内注入 100 μL 自体全血（剪断尾尖取血），注射速度10 μL/min，注射结束后停留20 min 以防回流（sham 组在相应时间内注入等容量生理盐水）；随后拔出针头，用骨蜡密封注射孔，缝合切口。其中，有4 只大鼠在手术中死亡。

将大鼠分为假手术组（sham 组）、ICH 组、低剂量（60 mg/kg）NAR（low-dose NAR，NAR-L）组、高剂量（120 mg/kg［10］）NAR（high-dose NAR，NAR-H）组和NAR（120 mg/kg）+Nrf2 抑制 剂 ML385（30 mg/kg［11］）组，每组 18 只。分组完成后，NAR-L 组和 NAR-H 组大鼠灌胃给予相应剂量的NAR（溶解于5%羧甲基纤维素钠制成混悬液），NAR+ML385 组大鼠在灌胃给予120 mg/kg NAR 的同时腹腔注射30 mg/kg ML385（DMSO 溶解稀释），sham 组和 ICH 组给予等体积的5%羧甲基纤维素钠灌胃和DMSO 腹腔注射，每日1次，灌胃和腹腔注射的体积均为10 mL/kg，连续给药7 d。

3.2 神经功能评分 使用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）量 表［12］评估ICH 后大鼠的行为缺陷，神经功能由对动物分组不知情的研究人员进行评估。mNSS 由运动、感觉、平衡和反射测试组成。神经功能通过0～18 分进行分级（1～6 分，轻度损伤；7～12 分，中度损伤；13～18分，重度损伤；0 和18 分分别代表正常表现和严重神经功能缺损）。在神经功能损伤的严重程度评分中，不能完成测试或没有测试反射为1 分，得分越高表明神经功能损伤越严重。

3.3 脑含水量测定 脑含水量通过湿/干重法进行评估。每组随机选择6 只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉大鼠，然后将其断头。立即将大鼠的大脑取出并分成5 个部分，即对侧皮质（contralateral cortex，Cont-CX）、对侧基底神经节（contralateral basal ganglia，Cont-BG）、同侧皮质（ipsilateral cortex，Ipsi-CX）、同侧基底神经节（ipsilateral basal ganglia，Ipsi-BG）和小脑（cerebellum，CB）。CB 用作内部对照。将各部分放在预先称重的铝箔片上，用电子分析天平称量脑组织并记录湿重，然后在电烘箱中100 ℃干燥72 h，测得恒重。使用以下公式评估含水量：含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

3.4 BBB 通透性测定 BBB 通透性的定量分析通过伊文思蓝（Evans blue，EB）染料外渗进行评估［13］。每组随机选择6 只大鼠，将大鼠麻醉并通过尾静脉注射给予溶于生理盐水中的2%EB 溶液（4 mL/kg）。循环2 h 后，在深度麻醉下用250 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）进行心内灌注，以清除脑循环中残留的EB染料。随后，取出大脑，称重并在1 mL 50%三氯乙酸溶液中均质化。4 ℃、21 000×g离心20 min，上清液用乙醇以1∶3 稀释，在610 nm 处测定吸光度（A）。根据标准曲线计算EB 含量，EB 含量以μg/g 脑组织重量来表示。

3.5 FJC染色检测脑组织中退化神经元 为了检测退化的神经元，进行FJC 染色［14］。每组随机选择6只大鼠，用戊巴比妥钠麻醉后，大鼠用PBS 溶液和4%多聚甲醛经心灌注，迅速取出脑组织，预冷的生理盐水冲洗残留的血迹后，于冰上将脑组织分为三部分，一部分制备10%的组织匀浆，一部分-80 ℃冰箱保存备用，另一部分制备冰冻切片：脑组织用30%蔗糖溶液脱水、OCT 包埋，用冷冻切片机小心地将组织切成薄片。将脑组织冰冻切片（14 μm）浸入1%氢氧化钠溶液5 min，然后用蒸馏水冲洗切片并浸入0.06%高锰酸钾溶液中10 min。再次用蒸馏水冲洗后，将载玻片转移到溶解在0.1%乙酸载体中的0.0001%FJC 溶液10 min。用蒸馏水洗涤后，将载玻片放入50℃的烘箱中20 min。最后，切片在二甲苯中清洗5 min 并用DPX 封片剂固定。使用荧光显微镜在每张切片的血肿周围拍摄4张高倍图像，计数FJC 染色阳性（FJC+）神经元。

3.6 脑组织中 Fe2+、MDA 和 GSH 含量及 SOD 活性检测 切取部分脑组织，称重，按1∶9 的比例加入生理盐水于研磨机中进行研磨，制备组织匀浆，离心取上清液，BCA 法测定匀浆上清液中的总蛋白浓度。（1）按照Fe2+含量检测试剂盒说明书加入相应试剂，于593 nm 处测得吸光度（A），绘制标准曲线并计算Fe2+浓度。（2）按照试剂盒说明书检测匀浆中MDA 和GSH 含量及SOD 活性，MDA 含量用酶标仪在532 nm波长下测定A值，GSH 含量在420 nm 波长下测定A值，SOD活性在520 nm波长下测定A值。

3.7 DHE 荧光染色法检测脑组织ROS 水平 取脑组织冰冻切片（10 μm），与10 μmol/L DHE 在37 ℃下避光孵育30 min，PBS 洗涤切片3 次，封片，然后通过共聚焦显微镜（激发波长535 nm，发射波长610 nm）观察DHE 染色的荧光强度，并用ImageJ 软件分析平均荧光强度，表示脑组织中ROS水平。荧光强，表明ROS含量高。

3.8 Western blot 检测脑组织中铁死亡相关蛋白表达 取-80 ℃冰箱保存的脑组织，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液中匀浆提取总蛋白，并采用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白（用于检测Nrf2 水平）。12 000×g离心 10 min 取上清液，使用 BCA 法测定蛋白浓度。通过10% SDS-PAGE 分离等量的蛋白，然后转移到PVDF 膜上，将膜用5%脱脂牛奶封闭2 h，然后分别与Ⅰ抗［Nrf2（1∶1 000）、SLC7A11（1∶1 000）、GPX4（1∶500）、lamin B1（1∶1 000）和 GAPDH（1∶2 000）］在4 ℃下孵育过夜。随后，将膜与山羊抗兔IgG（HRP，1∶2 000）在室温下孵育2 h，使用增强化学发光（ECL）试剂盒显影观察蛋白质条带。使用ImageJ 软件分析条带的灰度值。以GAPDH（总蛋白）和lamin B1（胞核蛋白）作为内参照，量化目标蛋白的表达。

4 统计学处理

计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示，统计分析采用GraphPad Prism 9.0 软件，多组间比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用SNK-q检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NAR对ICH大鼠神经功能的影响

与sham组相比，ICH组大鼠mNSS评分显著升高（P＜0.05）；与 ICH 组相比，NAR-L 组和 NAR-H 组大鼠mNSS评分显著降低（P＜0.05）；与NAR-H 组相比，NAR-L 组和 NAR+ML385 组大鼠 mNSS 评分显著升高（P＜0.05），见图1。

2 NAR对ICH大鼠脑含水量的影响

各组中，Cont-CX、Cont-BG 和 CB 的含水量无显著差异（P＞0.05）。在Ipsi-CX 和Ipsi-BG 中，与sham组相比，ICH 组含水量显著升高（P＜0.05）；与ICH 组相比，NAR-L 组和NAR-H 组含水量显著降低（P＜0.05）；与 NAR-H 组相比，NAR-L 组和 NAR+ML385组含水量显著升高（P＜0.05），见图2。

Figure 1. Effects of NAR on mNSS score of ICH rats. Mean±SD. n=18.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.图1 NAR对ICH大鼠mNSS评分的影响

Figure 2. Effects of NAR on brain water content（BWC）in ICH rats. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.图2 NAR对ICH大鼠脑含水量的影响

3 NAR对ICH大鼠BBB通透性的影响

与 sham 组相比，ICH 组 EB 含量显著升高（P＜0.05）；与ICH组相比，NAR-L组和NAR-H组EB含量显著降低（P＜0.05）；与NAR-H 组相比，NAR-L 组和NAR+ML385 组 EB 含量显著升高（P＜0.05），见图3、4A。

Figure 3. EB staining of rat brain tissues in each group.图3 各组大鼠脑组织EB染色

4 NAR对ICH大鼠脑组织退化神经元的影响

与sham 组相比，ICH 组FJC+神经元数量显著增加（P＜0.05）；与 ICH 组相比，NAR-L 组和 NAR-H 组FJC+神经元数量显著减少（P＜0.05）；与NAR-H 组相比，NAR-L组和NAR+ML385组FJC+神经元数量显著增加（P＜0.05），见图5、4B。

5 NAR 对 ICH 大鼠脑组织 Fe2+、ROS、MDA 和GSH含量及SOD活性的影响

与 sham 组相比，ICH 组 Fe2+、ROS 和 MDA 含量显著升高，GSH 含量和SOD 活性显著降低（P＜0.05）；与 ICH 组相比，NAR-L 组和 NAR-H 组 Fe2+、ROS 和MDA 含量显著降低，GSH 含量和SOD 活性显著升高（P＜0.05）；与 NAR-H 组相比，NAR-L 组和 NAR+ML385 组 Fe2+、ROS 和 MDA 含量显著升高，GSH 含量和SOD活性显著降低（P＜0.05），见图6。

6 NAR 对 ICH 大 鼠 脑 组 织 Nrf2、SLC7A11 和GPX4蛋白水平的影响

Figure 6. Effects of NAR on Fe2+（A），ROS（B），MDA（C）and GSH（D）content，and SOD activity（E）in brain tissues of ICH rats. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.图6 NAR对ICH大鼠脑组织Fe2+、ROS、MDA和GSH含量及SOD活性的影响

与 sham 组相比，ICH 组大鼠脑组织 Nrf2、SLC7A11 和 GPX4 蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与ICH 组相比，NAR-L 组和 NAR-H 组大鼠脑组织 Nrf2、SLC7A11 和 GPX4 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与NAR-H 组相比，NAR-L 组和 NAR+ML385 组大鼠脑组织Nrf2、SLC7A11 和GPX4 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图7。

讨 论

铁是一种血红蛋白降解产物，ICH 后铁会在血肿周围积聚，引起急性脑水肿和延迟性脑萎缩，进而导致神经功能缺损。此外，铁对于铁死亡的发生至关重要，细胞内铁依赖性脂质过氧化物积累，可降低GPX4 表达，诱导铁死亡；而通过铁螯合剂结合游离的铁离子可以减少铁死亡。在本研究中，我们观察到在ICH 大鼠神经元中发生了铁死亡，这可以通过ROS、Fe2+含量和MDA（脂质过氧化产物）含量的增加以及GSH 含量、SOD 活性和GPX4 表达的减少来证明。这与以往的研究结果一致，表明铁死亡在ICH中具有重要作用。Li 等［15］报道，铁死亡导致 ICH 后神经元死亡，抑制神经元铁死亡可以减轻ICH 后脑损伤。

据报道，NAR 在铁稳态中发挥重要作用［16］，可减轻大鼠海马中铁过载诱导的焦虑样行为障碍、线粒体功能障碍和乙酰胆碱酯酶活性，发挥神经保护作用，可作为一种铁螯合抗氧化剂［17］。为了进一步评估NAR 对ICH 大鼠模型脑损伤的影响，我们评估了行为缺陷、BBB 损伤、脑水肿和血肿周围脑组织的退化神经元，结果显示，NAR 可以改善ICH 大鼠的神经功能，降低脑水肿和BBB 通透性，并显著减少了ICH大鼠的神经元退化，说明NAR 对ICH 诱导的脑损伤具有保护作用。这与以往的研究结果一致，再次证实NAR 的神经保护作用。但在BBB 通透性检测中，可以观察到EB 以穿刺点为中心向外扩散，表明EB外渗与注血导致的机械创伤有关，这可能会对BBB通透性的分析产生不利影响，在未来的研究中将考虑是否存在非创伤性的造模方法可以减少机械创伤对BBB 通透性的影响。此外，本研究结果显示，NAR降低了ICH 大鼠脑组织中Fe2+含量和脂质过氧化标志物（ROS 和MDA）水平，并增加了GSH 含量、SOD活性和GPX4 表达。GPX4 是一种抗氧化酶，可将脂质过氧化物转化为无毒脂质，从而抵抗脂质过氧化，进而防止铁死亡。当GPX4活性降低时，无法抑制细胞内ROS 的产生，导致脂质过氧化物的积累和致死量的 ROS，从而诱导细胞发生铁死亡［18］。GSH 是GPX4 的合成底物，是GPX4 发挥抗氧化功能的辅助因子，目前被认为是铁死亡的关键调节因子［19］。提示，NAR 对ICH 大鼠脑损伤发挥保护作用的分子机制可能与铁死亡有关。

Figure 7. The protein expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in rat brain tissues in each group. Western blot was used to detect the protein expression levels of Nrf2，SLC7A11 and GPX4. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs ICH group；&P＜0.05 vs NAR-H group.图7 各组大鼠脑组织中Nrf2、SLC7A11和GPX4的蛋白表达

Nrf2 是 NAR 发挥神经保护作用的重要靶点［20］。Xu 等［9］的研究显示，NAR 可通过激活 Nrf2-GPX4 轴抑制铁死亡来减轻心肌缺血/再灌注损伤。Nrf2在抗氧化中起关键作用，也被认为是铁死亡的重要调节因子，可调控铁死亡途径中大多数酶和蛋白质的表达，如 GPX4、SLC7A11、FTH1 和 TfR1［21］。SLC7A11是一种关键的铁死亡调节剂，通过维持氧化还原的稳定状态作为铁死亡的负调节剂。本研究结果显示，ICH 大鼠脑组织神经元发生铁死亡的同时伴随着Nrf2（胞核）的下调，表明Nrf2 核易位被抑制，导致抗铁死亡基因和蛋白表达降低。而NAR促进了Nrf2的表达和核转位，上调了GPX4 和SLC7A11 表达；与Xu 等［9］的研究结果一致。因此，推测 NAR 可能通过激活Nrf2 通路减轻ICH 后的脑损伤。为了验证此推测，本研究在给予NAR 干预的基础上，使用Nrf2 抑制剂ML385 抑制Nrf2 的核转位，结果显示ML385 能明显减弱NAR 对Nrf2-GPX4 通路的激活作用以及对ICH 大鼠脑损伤的保护作用。提示，NAR 可能通过激活Nrf2-GPX4通路，抑制铁死亡。

综上所述，NAR 可能通过激活Nrf2-GPX4 通路，抑制铁死亡，减轻ICH 大鼠脑水肿和BBB 损伤，进而发挥脑保护作用。本研究表明NAR 可作为一种潜在的铁死亡抑制剂对ICH 诱导的脑损伤提供保护作用。但本研究仅对一种ICH 模型（自体血模型）进行了研究，未对其他ICH 模型（如IV 型胶原酶诱导模型）进行研究；在未来的研究中，将增加其他ICH 模型进一步验证NAR的脑保护机制。