小鼠小胶质细胞内SENP3介导的神经炎症在创伤性脑损伤中的作用机制研究*

顾艳兰 ， 赵思远， 陆秋霞， 张优利， 杜娟娟， 任艳华， 王万铁， 廖 敏△

（1温州医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，浙江 温州 325035；2温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所，浙江 温州 325035）

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）通常起源于原发性损伤，与脑部受到的外部打击直接有关，随着体内免疫反应的进行，损伤逐步发展为继发性损伤［1］。TBI 后，能量缺乏和细胞坏死产物的刺激导致大量炎症介质释放，引起神经细胞死亡，这些炎症介质进一步破坏血脑屏障，导致血液成分进入脑实质，更多的炎症细胞渗出和浸润，释放更大量的炎症因子［2］。原发性损伤在损伤后即刻发生，而继发性损伤可以进行治疗干预因而受到了更多的关注。其中中枢神经系统的固有免疫细胞——小胶质细胞参与的神经炎症在一系列继发性损伤中起到了推进作用［3］。TBI 所致的炎症反应始于组织损伤后释放的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）。DAMPs 短时内即可与小胶质细胞表面的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR）结合，激活的小胶质细胞为促炎作用的经典激活型（M1 型）和抑炎作用的代替激活型（M2型）的混合表型［4］。其中M1 型小胶质细胞在神经炎症中起到关键作用，因此探索小胶质细胞在TBI 导致的继发性损伤中的异常活化及引起的炎症反应对其治疗具有重要意义。

TLR 是一类主要表达于免疫细胞上的跨膜受体，在识别特异性配体后激活免疫炎症反应［5］。TLR主要通过核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径介导炎症反应。MAPK 信号通路的两个特异性激酶——丝裂原活化蛋白激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）和MKK7 能使 c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的第183位苏氨酸（Thr183）和第185位酪氨酸（Tyr185）位点磷酸化，从而激活JNK［6］。

MKK7 是哺乳动物细胞中MAPK 家族的成员之一，是TLR 信号通路的关键蛋白酶［6-7］。小泛素样修饰蛋白特异性蛋白酶3［small ubiquiton-like modifier（SUMO）-specific proteases 3，SENP3］主要定位于核仁，是一种氧化应激敏感蛋白，在氧化应激下发生亚细胞定位和稳定性的改变，可在胞质中迅速累积，特异性去除底物蛋白上的小泛素样修饰蛋白2/3（small ubiquitin-like modifier 2/3，SUMO2/3）［8］。体外研究表明，SENP3能够通过对MKK7进行去SUMO化来增强JNK 磷酸化，磷酸化的JNK 激活核内转录因子激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）的表达，产生大量促炎因子［9］。目前小胶质细胞内的 SENP3 与 TBI 后炎症反应的关系尚不明确。

BV-2 细胞系为 Blasi 等［10］在 1990 年应用携带癌基因v-raf/v-myc的反转录病毒J2 感染原代培养的小鼠小胶质细胞而获得的永生细胞系，该细胞系不仅高度纯化，而且基本具备了原代培养的小胶质细胞的形态学、表型以及各项功能特点。我们在此细胞系上建立机械性损伤模型，模拟TBI。此模型操作简单、稳定性好且重复性高［11］，是公认的体外TBI 研究模型。本研究拟利用此模型以研究小胶质细胞内的SENP3在TBI后的作用及其部分机制。

材料和方法

1 细胞培养

BV-2 细胞为实验室原有。使用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液，在5% CO2培养箱中维持37 ℃培养，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4传代。

2 主要试剂

DMEM/F12 培养液、胰蛋白酶及胎牛血清购自HyClone；RIPA 裂解液和 CCK-8 试剂盒购于 Beyotime；山羊源离子钙结合衔接分子1（ionized calciumbinding adapter molecule 1，Iba1）多克隆抗体购于Novus；兔源TLR4 单抗、兔源诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）单抗、兔源SENP3 单抗、兔源 p-JNK 单抗及兔源 SUMO2/3 单抗均购于Cell Signaling Technology；兔源白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 IL-6 抗体均购于 Abcam；DyLight 594标记驴抗兔荧光Ⅱ抗和DyLight 488标记驴抗羊荧光Ⅱ抗购于Jackson ImmunoResearch；内参照鼠抗β-actin 多克隆抗体购于Abgent；其他试剂均为国产分析纯；所用引物由上海生工生物工程有限公司根据设计合成，序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers used in RT-PCR

3 主要方法

3.1 体外TBI模型的构建 以1 000 μL的微量移液器塑料吸头于6 孔板内划割，造成BV-2 胶质细胞机械性损伤，轻度损伤（light）组横竖各划两道，重度损伤（heavy）组横竖各划三道（图1）。依据事先在培养板底面画好的标记线划割培养的细胞，标记线均匀分布在培养皿底面，保证同一组内的细胞损伤范围与程度一致。

Figure 1. Schematic diagram of constructing an in vitro traumatic brain injury model.图1 构建体外创伤性脑损伤模型的示意图

3.2 CCK-8 实验测定细胞活力 细胞处理结束后，根据说明书每孔加入100 μL的CCK-8混合液（VCCK-8∶VDMEM培养液=1∶10），放入常氧培养箱孵育0.5 h～2 h，置酶标仪于波长450 nm处测量吸光度（A）值。

3.3 细胞内过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）浓度的测定 将细胞在H2O2测定试剂盒提供的200 μL裂解缓冲液中裂解，12 000×g离心10 min 收集上清液，用于测定细胞内H2O2浓度。将样品溶液（50 μL）与反应溶液（100 μL）在室温下孵育30 min，然后测量560 nm 处的吸光度（A）。H2O2浓度由标准溶液制成标准曲线计算。

3.4 Western blot实验 提取各组细胞蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。采用SDS-PAGE 分离蛋白，半干转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入抗TLR4、SENP3、MKK7、p-JNK、SUMO2/3、IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS、精氨酸酶1（argi-nase 1，ARG1）和β-actin 抗体，稀释度均为1∶1 000，4 ℃过夜，TBST 清洗后加Ⅱ抗37 ℃孵育2 h，清洗后ECL 化学发光及显影。采用ImageJ 软件分析目的条带。实验重复3次，取3次的均值作为实验结果。

3.5 免疫荧光细胞化学染色 各组细胞爬片经丙酮固定，0.5% Triton X-100 破膜，血清封闭，加入Ⅰ抗［兔抗SENP3（1∶400）和兔抗Iba1（1∶1 000）］，4 ℃孵育过夜，PBS 清洗，加荧光Ⅱ抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h。PBS 清洗，DAPI 复染细胞核，室温孵育3 min。PBS 清洗，抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜在10×10倍下摄片。

3.6 RT-PCR Trizol 法提细胞总RNA：每孔细胞加1 mL Trizol，用加样枪吹至液体澄清且无细胞团，吸取至1.5 mL EP 管，颠倒混匀后室温静置5 min；每管加氯仿200 μL，颠倒混匀后室温静置5 min；4 ℃、12 000×g离心 15 min；转上层水相 400 μL 于另一1.5 mL EP 管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置 10 min；4 ℃、12 000×g离心 10 min；弃上清，加预冷DEPC 水配制的75%乙醇200 μL，4 ℃、12 000×g离心 5 min；弃上清，空气干燥 5～10 min 后，每管加30 μL DEPC 水溶解，立即用于逆转录或分装-80 ℃保存。提取RNA，浓度定量后，据逆转录说明书进行20 μL 体系反转录及 25 μL 体系 RT-PCR，待反应结束后，进行mRNA相对表达水平的分析。

3.7 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染实验 转染前1 d 以每孔1×105个细胞的密度接种于 6 孔板；取 5 μL 20 μmol/L 的 siRNA 加入无血清抗生素的培养基中，定容至100 μL，再加入 5 μL 转染试剂，吹打混匀后室温静置10～15 min；将100 μL 转染复合物加入含有2 mL 培养液的细胞中，摇晃混匀，于5%CO2、37 ℃培养箱孵育6～18 h 后换液，继续培养至48 h。siRNA序列如下：

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0 软件统计分析，实验结果用均数±标准差（meas±SD）表示。各组间采用t检验或单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学显著性。

结 果

1 TBI 后小胶质细胞内SENP3 表达上调并伴随TLR4信号通路的激活

损伤后6 h 细胞活力开始下降，在12 h 降到最低，并且至24 h 回升，见图2A；细胞内H2O2浓度在损伤后12 h降到最低，至24 h回升，见图2B。这提示损伤后氧化应激的程度在损伤后12 h 最高，我们推测SENP3 在细胞中积累程度也最高，因此本次研究选取损伤后12 h 作为观察时点。随着损伤程度的加重，SENP3、p-JNK 和 SUMO2/3 的蛋白水平逐渐升高（P＜0.05 或P＜0.01），MKK7 在重度损伤 12 h 后显著升高（P＜0.01），但轻度损伤组与对照组比较无显著差异，见图2C。随着时间的推移（重度损伤模型建立6 和 18 h 后），SENP3 蛋白表达水平及 JNK 磷酸化水平逐渐升高（P＜0.05 或P＜0.01），TLR4 在损伤后表达水平显著升高（P＜0.01），但在损伤6 h和18 h组间无显著差异，见图3。

2 TBI后SENP3促进小胶质细胞向M1型极化

以Iba1 作为小胶质细胞的标志物，免疫荧光染色结果显示，重度损伤组中的小胶质细胞内SENP3表达水平显著高于其他两组（P＜0.01），见图2D。分别以iNOS和ARG1为M1和M2型小胶质细胞的标志物，Western blot 结果显示，在重度损伤模型建立后6和18 h（对照组不作处理），iNOS 和TNF-α 的蛋白相对表达水平逐渐升高（P＜0.05 或P＜0.01）；IL-1β 在重度损伤后显著升高（P＜0.05），且在损伤6 和18 h后无显著差异；IL-6 在损伤后6 h 无显著变化（P＞0.05），在 18 h 显著下降（P＜0.01）；ARG1 蛋白表达水平在6 h 时显著下降（P＜0.01），且18 h 与6 h 相比无显著差异，见图4A。同时，RT-PCR 结果显示，NOS2的mRNA 水平在损伤后显著升高（P＜0.05），但在损伤 6 h 和 18 h 后无显著差异；TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的mRNA 水平随时间推移而逐渐升高（P＜0.05 或P＜0.01），见图4B。

3 SENP3 下调显著降低TLR 信号通路的激活及相关炎症因子的释放

我们利用siRNA 特异性敲减SENP3后，Western blot 结果显示，SENP3 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），TLR4 信号通路上的 MKK7 蛋白表达水平略有下降但差异无统计学意义（P＞0.05），JNK 的磷酸化水平显著降低（P＜0.01），同时IL-1β和TNF-α蛋白表达水平均较对照组显著下降（P＜0.05或P＜0.01），见图5。

Figure 2. The elevation of SENP3 in microglia after traumatic brain injury was positively correlated with the activation of TLR4 signaling pathway. A and B：the BV-2 cells were heavily damaged for 0，6，12，18 and 24 h，and the cell viability and the level of H2O2 were detected by CCK-8 assay and H2O2 assay，respectively；C：the BV-2 cells were damaged at different degrees（light and heavy）for 12 h，and the protein levels of SENP3，MKK7，p-JNK and SUMO2/3 in the BV-2 cells were detected by Western blot；D：the BV-2 cells were damaged at different degrees（light and heavy）for 12 h，and the effect of traumatic brain injury on the expression of SENP3 in the BV-2 cells was detected by immunofluorescence staining. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 h group；##P＜0.01 vs 18 h group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control group；▲▲P＜0.01 vs light group.图2 创伤性脑损伤后小胶质细胞内SENP3的上调伴随着TLR4信号通路的激活

Figure 3. The elevation of SENP3 in microglia after traumatic brain injury promoted the activation of TLR4 signaling pathway. BV-2 cells were heavily damaged for 0，6 and 18 h，and the protein levels of TLR4，SENP3，p-JNK and MKK7 at 6 h and 18 h after injury were detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，##P＜0.01 vs 6 h group.图3 创伤性脑损伤后小胶质细胞内SENP3的上调促进TLR4信号通路的激活

讨 论

TBI 是头部遭受外力打击导致的一种严重神经系统损伤性疾病，已成为全球范围内重要的公共卫生问题［1］。抑制免疫反应导致的继发性损伤是改善TBI 预后的有效方法。本研究利用小胶质细胞建立体外划痕损伤模型，模拟TBI，揭示SENP3 或为TBI后神经炎症的重要参与者。

小胶质细胞是大脑中主要的常驻免疫细胞，被认为是TBI后神经炎症的关键参与者［12］。

已有研究表明，在巨噬细胞中的SENP3 能够通过对MKK7去SUMO化来增强JNK的磷酸化，从而激活AP-1 表达，产生大量的促炎因子［11］。我们的实验结果提示，随着损伤程度的加重及损伤后时间的推移，小胶质细胞内SENP3蛋白表达持续上升，并伴随着TLR4 信号通路的激活。这一结果提示SENP3 能够通过对MKK7 进行去SUMO 化，增强JNK 的磷酸化，促进TLR4 信号通路的激活，最终促进炎症因子的释放。

活化的M1 型小胶质细胞的特征是释放促炎因子，可进一步加剧组织炎症和损伤，是影响TBI 预后的关键因素［13］。本研究表明SENP3表达的上升能够促使损伤后的小胶质细胞向M1型分化，并且分泌大量的炎症因子，促进脑部炎症的发生与发展。最后我们用siRNA 敲减SENP3，使得小胶质细胞中MKK7的表达略有下降，JNK 的磷酸化受到抑制，并且使炎症因子的表达显著降低，验证了SENP3对于TLR4信号通路以及小胶质细胞极化的促进作用。

Figure 4. SENP3 promoted M1 type polarization of microglia after traumatic brain injury. The BV-2 cells were heavily damaged for 0，6 and 18 h. A：the protein levels of iNOS，ARG1，IL-1β，TNF-α and IL-6 at 6 h and 18 h after injury were detected by Western blot；B：the mRNA expression of NOS2，TNF-α，IL-1β and IL-6 was determined by RT-PCR. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 6 h group.图4 创伤性脑损伤后SENP3促进小胶质细胞向M1型极化

Figure 5. Knockdown of SENP3 significantly reduced the activation of TLR4 signaling pathway and the release of related inflammatory factors. The protein levels of SENP3，p-JNK，MKK7，IL-1β and TNF-α in BV-2 cells were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-Con group.图5 敲减SENP3显著降低TLR信号通路的激活及相关炎症因子的释放

综上所述，本实验结果说明，损伤后小胶质细胞内SENP3 表达水平升高，TLR4 信号通路被激活，并伴随小胶质细胞向M1 型极化，释放大量炎症因子；利用siRNA 敲减SENP3的结果表明，降低SENP3 表达水平抑制了TBI 导致的TLR4 信号通路激活及小胶质细胞向M1 型的极化。这些结果提示SENP3 可能在TBI后继发性损伤中发挥了重要作用。