基于高通量测序的清水竹笋加工关键环节细菌污染状况分析

戴奕杰，汤娇娇，李 珂

(1.贵阳学院 生物与环境工程学院，贵州 贵阳 550005；2.贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室，贵州 贵阳 550005；3.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410125）

竹笋广泛分布于中国长江以南地区。因其具有的生长季节性限制，新鲜竹笋并不能得到全年供应，而采后迅速木质化降低了新鲜竹笋的营养品质和适口性。同时，新鲜竹笋会发生褐变或变黄，尤其集中体现在采收时的切面。采后贮藏措施可以延长竹笋的货架期，但不能保证竹笋的全年供应。为此，对新鲜竹笋进行不同的加工处理是必要的，包括发酵、煮沸、热烫、罐装和腌制。其中，罐装、干燥和发酵最为常见[1]。竹笋在剥壳、挑选、整形等加工环节必然会产生以笋壳、笋头以及预煮水等为主的废弃物，这些废弃物堆积后若得不到及时处理，微生物生长繁殖加剧，将污染竹笋加工厂周围环境。

食源性疾病是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质等致病因子所造成的疾病。可分为感染性和中毒性，包括常见的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、寄生虫病以及化学性有毒有害物质所引起的疾病[2]。根据竹笋加工厂的竹笋预处理过程，在新鲜竹笋剥壳后极易受到操作者携带的病菌污染，随后进行预煮环节[3]，虽经过高温处理，但仍有耐热致病菌芽孢存在，二次供水的清洁程度也会直接影响竹笋制品安全性，进入操作台后工作人员在挑选、整形过程的不当操作也可能导致竹笋制品的安全隐患。

本研究拟对竹笋加工厂二次供水及竹笋分割整形操作台上竹笋残渣进行采样，通过菌落总数测定、16S rDNA扩增子测序结合Tax4Fun功能预测分析该竹笋加工厂微生物污染情况，重点关注与人类疾病密切相关致病菌的相对丰度及基因表达状况，为竹笋加工厂食源性疾病的预防提供理论依据，并提出相应对策建议。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

竹笋加工厂二次供水以及操作台上竹笋边角料等竹笋残渣：湖南某竹笋加工企业；NaCl（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

NovaSeq6000型高通量测序分析仪：美国Illumina公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：美国Axygen Biosciences公司；QuantiFluor™-ST：美国Promega公司；TS-2102C型立式恒温振荡器：上海天呈实验仪器制造有限公司；XK97-A型菌落计数器：姜堰市新康医疗器械有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA的提取和PCR扩增

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法对样本的基因组脱氧核糖核酸（DNA）进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，选择通用引物 515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 扩增DNA中V3、V4区域。使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs 公 司 的 Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行聚合酶链式反应（PCR），确保扩增效率和准确性。

1.3.2 PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用荷兰Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

1.3.3 文库构建和上机测序

使 用 TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。

1.3.4 菌落总数测定

菌落总数测定依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》进行。具体步骤：无菌条件下称取25 mL二次供水以及25 g竹笋残渣样品于225 mL具有适量无菌玻璃珠的生理盐水中，在恒温振荡器（120 r/min）震荡2 min后，用生理盐水进行稀释。取10-1和10-2稀释度样品各1 mL，分别用（46±1） ℃的灭菌平板计数琼脂15～20 mL倾注平皿，转动混匀，每个稀释度倾注两个平皿。待琼脂凝固后倒置平板，经（36±1）℃培养（48±2）h后，用放大镜和菌落计数器记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示，每批次样品检测3份。

2 结果与分析

2.1 菌落总数

通过对竹笋加工厂二次供水和竹笋残渣菌落总数检测，二次供水中检测到菌落总数为1.5×102CFU/mL，竹笋残渣中检测到的菌落总数为9.2×103CFU/g，可以发现竹笋残渣微生物总量更大，受污染更严重。

2.2 细菌序列丰度及多样性分析

如图1（a）所示，所有样品曲线形状相似均趋于平坦，说明6个样品细菌组成均匀程度相近。如图1（b）所示，6个样品的曲线均趋于平坦，说明测序数据足以覆盖所有的细菌，表明6个样品中细菌具有多样性。二次供水的Shannon指数［图1（c）］和Simpson指数［图1（d）］均高于竹笋残渣，说明二次供水中的细菌多样性高于竹笋残渣，而且ACE指数［图1（e）］和Chao1［图1（f）］越高表明二次供水的物种丰富，分配更均匀。

图1 竹笋残渣及二次供水的序列丰度及Alpha-多样性

2.3 细菌群落结构分析

Venn图可以更加直观的表现出样品独有和共有的操作单元（OUT）数目，表现样本的OTU数目组成相似性及重叠情况。图2为竹笋加工厂二次供水及竹笋残渣中OTU数目的重叠情况，重叠OTU数目为79，占总OTU数目的56.43%，二次供水和竹笋残渣独有的OTU数目分别为40和21，占总OTU数目的28.57%、15.00%，说明两个样本间微生物之间存在一定相似性。

图2 OUT水平上的Venn图

主坐标分析（PCoA）是通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构[4]。本研究基于Weighted Unifrac距离来进行PCoA分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。由图3可以看出，竹笋加工厂二次供水和竹笋残渣组内三点之间呈现明显聚集状态，说明组内菌落结构差异较小；而二次供水与竹笋残渣两样品组间距离相差较大，说明竹笋加工厂二次供水和竹笋残渣之间菌落结构有一定差异。

图3 基于Unweighted UniFrac距离的PCoA图

2.4 物种相对丰度柱状图

如图4所示，竹笋水及竹笋废弃物中相对丰度排名前15的细菌为巴黎链球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸明串珠菌、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、大肠杆菌、棉籽糖乳球菌（Lactococcusraffinolactis）、武侯氏不动杆菌、鲸魏斯氏菌（Weissellaceti）、炭疽芽孢杆菌、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、加纳魏氏菌（Weissella ghanensis）、睾酮假单胞菌（Comamonastestosteroni）、热死索丝菌（Brochothrixthermosphacta）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。

图4 细菌属水平、种水平相对丰度柱状图

巴黎链球菌是一种条件致病菌，可能具有毒力岛和致病基因[5]，可通过入侵肠道导致儿童腹泻。Marmolin等[6]研究了链球菌的不同亚种对人类感染性心内膜炎和胃肠道疾病之间的可能联系，强调了巴黎链球菌导致的菌血症患者的1年致死率达到66.7%。此外，诊断为巴黎链球菌导致菌血症的患者中，26.3%患有癌症，并且这些癌症中的80%在胃肠系统之外，除非进行诸如核磁共振成像或正电子发射断层扫描之类的检查，否则难以诊断。王丽君[7]从乳房发炎的奶牛乳样中通过16S rRNA基因克隆测序确定巴黎链球菌2株，表明巴黎链球菌是潜在导致奶牛乳腺炎的致病菌，这与Chen等[8]对患乳腺炎奶牛分离的巴黎链球菌研究相一致。Almuzara等[9]研究表明巴黎链球菌可能会促进细胞内侵袭，而随后侵入宿主细胞保护细菌免受抗菌剂的侵害，并导致慢性感染的发展。巴黎链球菌在二次供水和竹笋残渣中平均相对丰度分别为0.207和0.554，均占据首位。

不动杆菌是一类革兰氏阴性菌[10]，其中某些菌种是条件致病菌。有关武侯氏不动杆菌研究较少，该菌于2018年被Hu等[11]首次检测出，其病理学作用机制仍需进一步挖掘研究。热死索丝菌为革兰氏阳性微需氧无芽孢菌[12]，主要存在于肉制品中，是真空、冷冻包装肉制品主要腐败菌之一[13-14]。大肠杆菌是常见病原菌，呈革兰氏阴性，存在于生物肠道内，在一定条件下可以引起人体发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染[15]，在竹笋加工厂二次供水中平均相对丰度为0.013 0，居于第6位，在竹笋残渣中平均相对丰度为0.003 8，居于第8位。炭疽芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，芽孢抗毒性强，可导致家畜、人类患炭疽病。在二次供水及竹笋残渣中平均相对丰度分别为0.001 8、0.000 5。

2.5 Tax4Fun功能预测

Tax4Fun功能预测是通过基于最小16S rRNA序列相似度的最近邻居法实现的[16]，其具体做法为提取KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列并利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）算法将其比对到SILVA SSU Ref NR数据库（BLAST bitscore＞1 500）建立相关矩阵，将通过UProC和PAUDA两种方法注释的KEGG数据库原核生物全基因组功能信息对应到SILVA数据库中，实现SILVA数据库功能注释。测序样品以SILVA数据库序列为参考序列聚类出OTU，进而获取功能注释信息。

如图5所示，二次供水及竹笋残渣中化能异养型生物及发酵作用基因表达平均值较高，化能异养生物可分为腐生型和寄生型[17]，腐生型可从无生命有机物获得营养物质，会引起食品腐败变质，如毛霉、根霉以及芽胞杆菌[18]等。寄生型生物必须寄生在活的有机体内，从寄主体内获得营养物质[19]，能够引起动植物的微生物病害，如普遍存在的链球菌和大肠杆菌。发酵作用微生物主要以乳球菌、乳杆菌以及明串珠菌占优势，且竹笋残渣发酵作用极显著高于二次供水（P=0.007）。二次供水中表达量高且显著高于竹笋残渣的表达基因是植物病原体（P＜0.001），竹笋残渣中表达量高且与二次供水具有显著区别的基因有人类病原体（P=0.027）以及寄生虫（P=0.027）。

图5 KEGG聚类T-Test分析图

3 结论与讨论

本文针对竹笋加工厂二次供水及竹笋残渣进行菌落总数测定，发现竹笋残渣中菌落总数显著高于二次供水，表明竹笋残渣受微生物污染严重。通过16S rDNA扩增子测序分析、Venn图和PCoA分析表明竹笋加工厂二次供水和竹笋残渣微生物群落结构具有一定的相似性，可能是竹笋残渣长时间堆放发酵，微生物快速生长繁殖，导致工厂周围水资源中的微生物群落结构改变，并趋于一致。物种相对丰度图中显示竹笋加工厂二次供水和竹笋残渣中top5细菌为巴黎链球菌、乳酸乳球菌、食窦魏斯氏菌、乳酸明串珠菌、发酵乳杆菌。其中巴黎链球菌已经被证明可通过食物进入人体肠道，入侵宿主细胞保护致病菌，促进细胞内侵害，诱导腹泻、痢疾等肠道疾病。本研究发现巴黎链球菌在竹笋残渣中的相对丰度高于二次供水，推测竹笋残渣是巴黎链球菌主要来源。二次供水和竹笋残渣中还具有其他相对丰度较高的条件致病菌，如武侯氏不动杆菌、热死索丝菌、大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌等均可能通过食物导致人体患肠道、皮肤疾病。进一步通过Tax4Fun功能预测分析二次供水及竹笋残渣中与致病微生物基因表达相关联的功能特性，发现二次供水及竹笋残渣中化能异养型生物基因表达量最高，通常以寄生细菌为主，特别是相对丰度较高的巴黎链球菌。二次供水植物病原体基因表达量显著高于竹笋残渣，而竹笋残渣中人类病原体及寄生虫相关基因表达量高于二次供水，表明二次供水及竹笋残渣中均含有对人体有害微生物，并且其基因表达量较高，直接影响竹笋加工制品安全性[20-21]。

显然，竹笋加工厂二次供水及竹笋残渣均在一定程度上受到致病微生物污染。因此，提高企业卫生安全意识，加强卫生监管工作，有效控制操作人员卫生状况是十分必要的。

竹笋加工厂二次供水及竹笋残渣中发酵用细菌相对丰度较高，通过Tax4Fun功能预测也侧面表明了关于食品发酵基因表达较高，这也为竹笋加工厂提供丰富的微生物资源，可针对二次供水及竹笋残渣进行微生物培养分离鉴定，将分离得到的具有益生性能的细菌接种于竹笋残渣中，从而抑制其他腐败微生物生长繁殖，有效控制微生物污染周围水资源，再将发酵后竹笋残渣制备成青贮饲料等进行二次利用[22]。因此，将竹笋残渣及时收集并利用乳酸菌发酵处理，既能够解决竹笋加工厂水资源微生物污染以及竹笋残渣腐败发臭问题，又能提高竹笋加工厂的经济效益。与此同时，二氧化氯作为新型消毒剂，在果蔬、水产品、饮品中具有高效安全性[23]。竹笋厂在对二次供水进行处理时，可在其中加入0.7 mg/L二氧化氯[24]进行杀菌消毒；竹笋整形阶段，间隔1 h用二氧化氯水清洗台面，可以有效控制微生物污染。