基于IL33/ST2 信号通路探究芍药汤对溃疡性结肠炎大鼠的干预效果

曾婷婷，朱 卫

（湖南中医药大学第一附属医院肛肠科，长沙 410021）

溃疡性结肠炎发病机理尚未明确，其主要临床特征以结肠弥漫性炎症及直肠黏膜出血为主，是常见的肠系统紊乱疾病[1]。研究[2]表明，在溃疡性结肠炎发生过程中，IL-33/ST2 信号通路会协同免疫因子介导其免疫反应，同时也会促进炎症因子的释放，发挥炎症级联反应。中医学认为，溃疡性结肠炎属于“泄泻”“痢疾”“肠澼”范畴，该病病机为湿热内生、气血瘀滞、内蕴肠腑，治疗中以调和气血、清热燥湿为主，芍药汤是治疗该病的有效药方[3-4]。本研究以IL-33/ST2 信号通路为接入点，探究芍药汤对溃疡性结肠炎大鼠的干预效果，以期为溃疡性结肠炎的临床治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 研究动物 选购50 只SPF 级SD 大鼠，均购自北京大学医学院实验动物中心，合格证号：YXK（京）2021-0013，体质量（192.54±40.38）g，饲养严格依照实验动物饲养管理规定进行，湿度控制在50%～65%，温度控制在18～28℃，适应性饲养1 周。

主要试剂与仪器：所有ELISA 试剂盒均购自上海广锐生物科技有限公司；5%TNBS 水溶液（美国Sigma 公司，批号：P2297-5X10ML）；兔抗鼠免疫球蛋白A、CD4+T 淋巴细胞、亚型前列腺素过氧化物合成酶一抗，兔抗鼠β-肌动蛋白一抗（武汉博士德生物公司，批号BC025782，BH071954，BG003453，BM0621）；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：20081206）；兔抗鼠分泌型免疫球蛋白一抗（上海康朗生物公司，批号KL8098）；白介素-33、ST2单克隆抗体（CST 公司）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；全自动化学发光分析仪（美国Bio-Rad 公司）；凝胶成像系统（日本奥林巴斯公司）；显微镜（日本Nikon 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型构建 分组：将50 只大鼠采取编号抽签法随机分为正常组（A 组）、溃疡性胃炎模型组（B组）、低剂量芍药汤组（C 组）、中剂量芍药汤组（D组）、高剂量芍药汤组（E 组），每组各10 只。造模：第2 周开始，予B 组、C 组、D 组、E 组大鼠灌服猪油（15 g/kg），每2 天1 次，并在灌服猪油的次日灌服52 度白酒，灌服21 d，然后禁食禁水24 h，于腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）令大鼠麻醉。向大鼠肛门8 cm 左右处插入甘油润滑硅胶管，向大鼠肠内缓慢推入2.25 mL 100 mg/kg TNBS+50%乙醇，推入完成后，体尾倒置大鼠30 s，确保造模液在大鼠肠内弥漫分布。造模完成后将大鼠仰卧送回笼中，待其自然苏醒后选择常规饲养方式饲养。参与造模的大鼠显示大便次数增多、肛门污秽、大便末端有脓点和黏液出现，存在腹泻现象，标志造模成功。

1.2.2 给药 造模成功后的第6 周开始给C 组、D 组、E 组灌胃，确定芍药汤低、中、高剂量分别为5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg 中药煎剂量，每日1 次。A 组与B 组均予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。各组连续干预7 d。芍药汤方药组成：黄芩15 g，当归15 g，黄连15 g，生白芍30 g，肉桂5 g，木香6 g，大黄9 g，槟榔6 g，甘草6 g。药材均购自浙江中医药大学门诊部，水提浓缩至每毫升2.0 g 生药。

1.3 观察指标

1.3.1 样本采集 治疗结束后，第7 周所有大鼠禁食不禁水24 h，大鼠均使用10%水合氯醛以3.5 mL/kg的用量行腹腔注射，进行麻醉，取大鼠腔内静脉血5 mL，高速离心，取上层血清。成功后将大鼠置于操作台解剖大鼠，自肛门2 cm 处向上取结肠6～8 cm，截取3 块大鼠结肠组织后置于生理盐水中冲洗，将2块组织石蜡包埋，制成4 μm 切片，一块置于-80℃冰箱中冻存。

1.3.2 病理组织学观察 取出包埋切片，进行HE染色。于200 倍光镜下，随机选取切片视野，观察各组大鼠、炎性细胞浸润、结肠上皮损伤等病理变化。

1.3.3 免疫球蛋白A（SIgA）、CD4+T 淋巴细胞、亚型前列腺素过氧化物合成酶（COX-2）表达 将大鼠肠组织切片取出，脱蜡、水合、灭活后进行抗原修复，加入5%牛血清白蛋白，使其封闭20 min。加入1:500的SIgA、CD4+、COX-2 一抗，在37℃下孵育1 h，利用PBS进行洗涤，加入1:2 000的二抗，孵育20 min 后显色，复染，烘干封片，200 倍显微镜下观察，并采集图片。

1.3.4 血清内皮素（ET）、白介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、细胞间黏附分子（ICAM-1）检测 采用酶联免疫法进行检测，取出冻存的血清标本，在室温中静置30 min，根据ELISA 试剂盒说明书规定将标准品配置成需要浓度。设置标准孔、待测样品孔和空白孔，依次向其中加入标准品、待测标本品和辣根过氧化物酶标记的相关检测抗体，孵育洗涤后用底物四甲基联苯胺进行染色，在酶标仪450 nm 处读取吸光度，绘制相关曲线，记录标本浓度。

1.3.5 IL-33、ST2 蛋白表达 采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测大鼠结肠黏膜组织中IL-33、ST2 蛋白表达水平。将肠黏膜组织切成细小碎片，加入裂解液，混匀使其完全裂解，完成后取适量样品，进行蛋白质定量检测，经电泳转膜后，利用脱脂奶粉封闭，将IL-33、ST2抗体加入封闭液中，介质进行稀释，在4℃环境中孵育12 h，加入HRP 标记的二抗，将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，进行扫描后在凝胶影像上分析条带。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析处理。计量资料采用均数±标准差（）描述，多组间比较采用方差齐性检验，2 组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠病理组织学观察 A 组大鼠结肠黏膜组织结构清晰完整，且细胞排列整齐，肠腺细胞形态规则，没有水肿、充血现象，杯状细胞数量较多，血管清晰可见。B组大鼠结肠组织黏膜缺失严重，细胞间质血肿、充血明显，且存在大量炎性细胞浸润，肉眼可见会发现溃疡灶。C 组、D 组、E 组结肠组织损伤程度不同，E 组结肠黏膜组织最为清晰，其次是D 组，细胞排列整齐程度也是E 组大于D 组大于C 组，C 组、D 组间质水肿及充血现象较为明显，仍有部分炎性细胞分布，腺体增生较为明显，E组与A组基本形态无明显差别。见图1。

图1 各组大鼠病理组织学观察

2.2 各组大鼠结肠黏膜组织中SIgA、CD4+T 淋巴细胞、COX-2 表达比较 与A 组相比，B 组SIgA、CD4+T 淋巴细胞水平明显降低，COX-2 水平明显升高（P＜0.05）；与B 组相比，C 组、D 组、E 组SIgA、CD4+T 淋巴细胞水平明显升高，COX-2 水平明显降低，且E 组SIgA、CD4+T 淋巴细胞升高水平，COX-2 降低水平明显优于C 组、D 组（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠结肠黏膜组织中SIgA、CD4+ T 淋巴细胞、COX-2 表达比较（，n =10）

表1 各组大鼠结肠黏膜组织中SIgA、CD4+ T 淋巴细胞、COX-2 表达比较（，n =10）

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05；与D 组比较，□P ＜0.05

2.3 各组大鼠血清ET、IL-4、TNF-α 水平比较 与A组相比，B组ET、IL-4、TNF-α表达明显升高（P＜0.05）；与B 组 相比，C 组、D 组、E 组ET、IL-4、TNF-α 表达明显降低，且E 组ET、IL-4、TNF-α 降低幅度明显优于C 组、D 组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清ET、IL-4、TNF-α水平比较（，n = 10）

表2 各组大鼠血清ET、IL-4、TNF-α水平比较（，n = 10）

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05；与D 组比较，□P ＜0.05

2.4 各组大鼠血清TGF-β1、ICAM-1 表达比较 与A组相比，B 组TGF-β1表达明显降低，ICAM-1 表达明显升高（P＜0.05）；与B 组相比，C 组、D 组、E组TGF-β1表达明显升高，ICAM-1 表达明显降低，且E 组TGF-β1/ICAM-1 升高/降低幅度明显优于C 组、D组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清TGF-β1、ICAM-1 表达比较（，n =10） μg/L

表3 各组大鼠血清TGF-β1、ICAM-1 表达比较（，n =10） μg/L

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05；与D 组比较，□P ＜0.05

2.5 各组大鼠结肠组织IL-33、ST2 蛋白相对表达量比较 与A 组相比，B 组IL-33、ST2 蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）；与B 组相比，C 组、D 组、E组IL-33、ST2 蛋白相对表达量明显降低，且E 组IL-33、ST2 的相对表达量降低幅度明显优于C 组、D 组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠结肠组织IL-33、ST2 蛋白相对表达量比较（，n =10）

表4 各组大鼠结肠组织IL-33、ST2 蛋白相对表达量比较（，n =10）

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05；与D 组比较，□P ＜0.05

3 讨论

溃疡性结肠炎是较为严重的非特异性肠道炎症疾病之一，属于一种自身免疫性疾病，且反复发作[5-6]。当前，临床中对溃疡性结肠炎的治疗主要以缓解病情、降低发病频次为主。溃疡性结肠炎的发病病因尚未明确，其发病原因主要和免疫、遗传、心理与环境等因素紧密相关。

中医学认为溃疡性结肠炎属于本虚标实病症[7]。芍药汤可调和气血、清热燥湿，方中君药芍药柔肝敛阴、养血和营，当归活血养血。臣药槟榔行气导滞、木香行气宽中、甘草健脾和中，大黄与肉桂调和诸药，诸药合用气血通达，湿热得祛[8-9]。IL-33 是白细胞介素细胞因子，其受体是ST2，IL-33/ST2 通路会参与多种疾病的发生发展[10-11]。IL-33/ST2 在受体辅助蛋白的作用下，会发挥促纤维化与促炎反应，在溃疡性结肠炎中对肠道黏液屏障的修复与肠道黏膜的保护有重要影响[12-13]。IL-33/ST2 通路也会参与肠上皮细胞生成，间接作用免疫反应平衡[14]。

本研究结果显示，采用芍药汤治疗的溃疡性结肠炎大鼠结肠组织损伤减轻，间质水肿及充血问题得到改善，炎性细胞分布较少，且高剂量芍药汤治疗的大鼠病理特征改善最为显著，其结肠组织基本形态和正常大鼠无太大差别。由此可知，芍药汤有促进结肠黏膜修复、延缓机体肠上皮细胞凋亡的功效，高剂量芍药汤对溃疡性结肠炎治疗效果最佳。

SIgA 有维持肠黏膜稳态作用。CD4+T 细胞是重要的免疫细胞，对免疫反应有强度控制[15-16]。COX-2 属于一种诱导型酶，是前列腺素过氧化物合成的亚型酶，对炎症因子IL-33 有刺激作用，水平的升高也会让机体发热、水肿、腹痛、腹泻程度增加[17]。本研究结果显示，采用高剂量芍药汤治疗的大鼠SIgA、CD4+T 淋巴细胞水平升高，COX-2 水平降低最为显著，可见芍药汤可以抑制对溃疡性结肠炎大鼠炎症反应，改善其免疫反应。本研究结果显示，采用芍药汤治疗的溃疡性结肠炎大鼠ET、IL-4、TNF-α 炎性因子、ICAM-1、COX-2 促炎因子表达明显降低，TGF-β1抑炎因子表达明显升高，高剂量芍药汤上述指标表达降低、升高程度最为显著，提示芍药汤可以改变炎症因子趋化性，促进抑炎因子表达。

研究[18]显示，溃疡性结肠炎患者肠道间质中IL-33 表达会升高。ST2 作为IL-33 的功能受体在巨噬细胞、Th2 细胞中表达广泛，当肠道组织细胞受损时IL-33 从凋亡细胞中得到释放，IL-33ST2 通路可将信号从细胞外传入细胞内，介导并计划下游的丝裂原活化蛋白激酶，促进IL-4、TNF-α 炎性因子的合成，促使疾病进程的发展[19]。IL-33ST2 会介导自杀杀伤T 细胞，并间接作用巨噬细胞及树突细胞，阻碍TGF-β1、CD4+T 淋巴细胞的分泌，影响黏膜保护作用的发挥[20]。SIgA 可聚集在溃疡性结肠炎患者肠黏膜组织中，对免疫平衡的维持和肠上脾细胞的完整性有重要作用，SIgA 可能通过IL-33/ST2 介导来参与肠道黏膜稳态的维持[21]。本研究结果显示，采用芍药汤治疗的溃疡性结肠炎大鼠IL-33、ST2 蛋白表达明显降低，且高剂量芍药汤治疗的溃疡性结肠炎大鼠IL-33、ST2 蛋白表达水平最为显著，由此可以推测，芍药汤会干预IL-33ST2 信号通路，下调其表达并抑制其促炎过程，调控IL-33/ST2 通路介导的免疫反应，激活相关免疫蛋白表达，修复黏液屏障，发挥黏膜保护机制，且高芍药汤调控IL-33/ST2 信号通路效果更为显著。

综上所述，芍药汤可以下调IL-33/ST2 表达，抑制IL-33/ST2 介导的炎症反应，改善免疫反应，减少肠黏膜病理损伤，发挥黏膜保护机制，治疗溃疡性结肠炎效果明显。