壳聚糖-β-磷酸三钙复合层状支架的制备与研究

陆依凡，邹多宏，丁如愿，侯爱兵

外伤、感染、肿瘤切除等原因通常会造成骨组织缺损，小范围的缺损常可以自愈，较大范围的缺损如临界骨缺损则无法实现自我修复。目前，临床上常用的方法有自体骨移植、异体骨移植，但供源短缺或者免疫反应等限制了其应用[1]。应用骨组织工程修复临界骨缺损近年来逐渐成为研究的热点，其中生物支架在整个修复过程中起到至关重要的过程，被称为组织工程的“基石”[2]。

壳聚糖(chitosan, CS)是一种丰富的天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、抗菌性、价格低廉等优点被广泛应用于组织工程研究中[3-5]。β-磷酸三钙(β-TCP)具有优异的降解性能和骨传导性，能够较好的修复骨缺损。本实验将CS和β-TCP混合，通过双向冻干技术制备了具有互相平行的薄层状、多孔状生物支架，该支架具有优异的压缩强度和弹性形变能力，良好的生物相容性以及诱导间充质干细胞成骨分化能力，具有修复临界骨缺损的潜力。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD雄性大鼠，3周龄，体质量(50±5)g，购自安徽医科大学实验动物中心，整个实验过程对动物处置均符合医学伦理学要求(批号：LLSC20200362)。

1.2 合成材料壳聚糖(85%去乙酰化程度)、 β-TCP(生物医用级，≥ 98%，β-phase basis，<0.2 μm，美国aladdin公司)。

1.3 主要试剂和仪器DEME、胰酶消化液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；BCIP/BNT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(上海碧云天公司)；二氧化碳孵育箱(美国Thermo公司)；CCK-8试剂(日本同仁公司)；酶标仪(美国Bio-tek公司)；激光扫描共聚焦显微镜LSM880、扫描电子显微镜(德国蔡司公司)；X线衍射仪(荷兰帕纳科公司)；高温高压灭菌锅(日本Hirayama公司)。PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；实时荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)；力学万能机(美国英斯特朗公司)。

1.4 方法

1.4.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 3周龄雄性SD大鼠脱颈处死，在超净工作台中去除表皮及肌肉组织。将后肢股骨两端骨骺端剪去，用5 ml注射器将骨髓冲出至培养皿中，加入含有20%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃，5%二氧化碳条件下进行培养，3 d后更换培养基，培养至7 d后对原代细胞进行传代。

1.4.2双向冻干制备CS-β-TCP支架 将CS-β-TCP溶液倒入预制的硅胶模具中，模具的一侧浸入液氮，使得冰核在溶液底生成并且呈现平行的、长程排列的冰片。冷冻完成后将其转入真空冻干机冻干，使用0.3 mol/L NaOH乙醇溶液对样品进行除酸，随后用去离子水反复清洗样品。

1.4.3 力学测试将冻干的复合组(CS-β-TCP支架)支架制备成10 mm×10 mm×10 mm的测试样品，通过力学万能实验机对样品进行压缩循环测试，以1 mm/s的速度将样品压缩40%、60%、80%，观察其回弹能力。记录压缩-回弹过程并绘制压缩循环曲线。

1.4.4结构表征 将CS-β-TCP支架制备成2 mm×2 mm×2 mm的测试样品，将样品截面以导电胶固定于样品台，低真空下喷金后使用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)在5 kV的加速电压下拍摄样品，能量分散光谱(energy disperse spectroscopy, EDS)观察各元素分布。将复合组支架平铺于试件台上，用X线衍射仪分析进行扫描，分析其组成成分。

1.4.5细胞生物相容性实验 用打孔器将复合组支架制备成直径5 mm，厚度2 mm的圆形样品。每个样品接种1×104个大鼠骨髓间充质干细胞，空白对照组仅在96孔板底接种细胞，每组5个副孔。1 d、4 d、7 d分别吸除培养基，PBS清洗两遍后，加入CCK-8溶液(CCK-8 ∶DEME=1 ∶9)200 μl/孔，37 ℃孵育2 h后使用酶标仪检测每孔在450 nm处的吸光度值。

1.4.6细胞活力和细胞黏附实验 ①细胞活力实验(活死染法)：大鼠骨髓间充质干细胞接种在支架上于96孔板中培养1、4、7 d后弃除原有培养基，PBS清洗3遍后，将10 μl calcein-AM和15 μl propidium iodide溶解于5 ml PBS中混匀，每孔加入100 μl 混合液，37 ℃孵育15 min后，PBS清洗3遍，使用激光共聚焦检测细胞染色情况，其中活细胞为绿色荧光，死细胞为红色荧光。②细胞黏附实验：大鼠骨髓间充质干细胞接种在复合组支架上3 d后，PBS清洗3遍，用4%多聚甲醛固定样品30 min。0.1%的Triton-X 100对支架上细胞破膜10 min，随后用1%的BSA溶液封闭样品1 h。使用0.1%的罗丹明标记的鬼笔环肽染色30 min，DAPI对细胞核染色5 min。随后用激光共聚焦进行检测。

1.4.7细胞成骨分化的检测 将5×105个鼠骨髓间充质干细胞分别接种在纯壳聚糖组和复合组支架上培养，每3 d换液1次，7 d时用TRIzol提取细胞中的RNA并根据试剂说明书逆转录合成cDNA。采用qRT-PCR检测骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)、RUNX相关转录因子2(RUNX family transcription factor 2, RUNX2)、一型胶原(collagen type I, COL1)的基因表达水平(引物序列见表1)。并对支架进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色，检测ALP活性。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1 CS-β-TCP支架表征CS-β-TCP支架的扫描电镜下呈现相互平行的薄层多孔结构，孔径大小均匀，且具有良好的贯通性。见图1A。图1B为CS-β-TCP支架的压缩循环曲线，结果表明CS-β-TCP支架具有良好的压缩性能，支架压缩80%后仍可恢复原有形状。

图1 CS-β-TCP支架的力学表征

2.2 CS-β-TCP支架的成分检测XRD结果显示，复合组支架中含有β-TCP颗粒，EDS结果表明，β-TCP颗粒均匀的分布在复合组支架的薄层结构上。见图2。

图2 CS-β-TCP支架成分分析

2.3 CS-β-TCP支架生物相容性实验CCK-8结果显示，大鼠骨髓间充质干细胞与材料共培养1、4、7 d后，与空白对照相比，纯壳聚糖组和复合组的吸光度无明显差异，细胞增殖未受到抑制，仍保持较高的增殖活性，见图3。

图3 支架与细胞共培养后的生物相容性

2.4 细胞活性检测结果如图4所示，支架上死细胞较少，细胞活性高，同时细胞表现出良好的增殖能力。复合组支架对细胞活性无影响。

图4 CS-β-TCP支架接种细胞后细胞活力检测Calcein：钙黄绿色，活细胞为绿色；PI：碘化钾，死细胞为红色

2.5 细胞黏附能力大鼠骨髓间充质干细胞接种在CS-β-TCP支架72 h 后，荧光染色结果表明细胞可以较好的黏附在复合组支架上。此外，细胞能够较好的张入层状微孔结构中，为细胞的黏附和分化提供了良好的力学刺激，见图5。

图5 细胞接种在CS-β-TCP支架72h后，细胞黏附的检测DAPI：染细胞核为蓝色；Phalloidin：染细胞骨架为红色

2.6 支架的促成骨分化能力qRT-PCR结果表明，和纯壳聚糖组相比，复合组的成骨相关基因BMP2, RUNX2 以及COL1 的表达增强，差异有统计学意义(P=0.000 3,F=55.78;P=0.000 3,F=38.20;P=0.021 5,F=15.91)，且培养至第7 d、14 d时，ALP染色结果显示，复合组的ALP阳性结果更加明显，见图6。

图6 CS-β-TCP支架的促成骨分化能力的检测A：成骨相关基因表达的检测；B：碱性磷酸酶染色

3 讨论

β-TCP是目前临床上较为常用的骨科材料，具有良好的生物相容性，骨传导性以及降解性[6-7], 广泛应用于临床骨缺损的再生修复。然而单纯的磷酸盐生物支架脆性较高，成分较为单一，不能较好的模拟天然骨的结构。常用的骨水泥作为骨组织缺损修复策略也具有一定局限性，其较小的孔径阻碍血管的长入，导致其中间部位营养缺乏而造成组织坏死，进一步影响缺损修复的效果。壳聚糖作为天然多聚物，其结构与骨组织中的糖胺聚糖相似，在成骨细胞的附着和矿化方面具有重要的作用[8-9]，但单纯壳聚糖的机械性能较差，作为支架修复骨缺损时不能提供足够的机械支持，从而影响骨组织的修复。本实验将β-TCP颗粒与壳聚糖溶液混匀，通过双向冻干技术制备的复合物支架，不仅能够降低β-TCP的生物脆性，提高壳聚糖的机械强度，同时有机物和无机物的结合使得CS-β-TCP复合层状支架能够更好的模拟骨组织的结构。双向冻干技术使得支架具备较多的孔径结构以允许血管组织的长入，能够更好的进行营养的交换和代谢物的更新，从而保证支架中心营养充足，加速骨缺损的修复。此外，平行的薄层状结构赋予支架优异的弹性性能，可以保证支架处于压缩状态而植入缺损部位，壳聚糖骨架的形状记忆能力使得支架能够自适应缺损的形状，这些特点使得CS-β-TCP复合层状支架在不规则缺损的修复和微创领域中具有一定的潜力[10]。

CS-β-TCP复合层状支架的扫描电镜可以观察到β-TCP颗粒均匀的分布在层状结构内，使得层状结构具有较为粗糙的表面，这种结构对于细胞的黏附可能具有一定的帮助，同时壳聚糖表面的正电荷可以吸引带负电的细胞膜，促进细胞的黏附[11-12]。间充质干细胞黏附于支架后，同时受到机械张力和钙离子的刺激而向成骨细胞分化。此外，壳聚糖可通过募集巨噬细胞从而减少炎症反应，使得CS-β-TCP复合层状支架在修复骨缺损的同时抑制炎症的发生,更好的促进骨缺损的修复[13]。体外细胞实验结果表明细胞可以较好的与支架共存，同时能够随培养时间的延长而增殖。这些结果证明该CS-β-TCP复合层状支架具备生物支架的基本要求，不会对机体产生毒副反应。

体外检测BMP2、RUNX2和COL1的变化可以反映间充质干细胞向成骨细胞分化的程度。qRT-PCR实验表明与阴性对照组(纯壳聚糖组)相比，复合组支架能够促进骨髓间充质干细胞显著表达BMP2、RUNX2和COL1基因，表明该复合组支架可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化。ALP是成骨分化的标志性酶，在骨矿化过程中起到重要作用[14]，对复合组支架进行ALP染色，与阴性对照组相比，复合组支架的阳性结果更为明显，表明该组支架上的间充质干细胞骨矿化程度更高。qRT-PCR和ALP染色结果共同表明复合组支架具有明显的促进间充质干细胞成骨分化能力。但本文所研究材料结构较为单一，成分上不存在梯度变化，对于复杂的缺损和位于两种组织交界处的缺损修复效果较局限，例如关节处缺损常涉及表面的软骨和软骨下骨组织，且骨和软骨组织具有不同的硬度和矿物质含量，单一支架难以同时修复骨和软骨缺损。因此该材料需进一步改进，使其能够适应复杂缺损处的梯度变化，从而实现复杂缺损的修复。

综上所述，本实验制备的CS-β-TCP复合层状支架具有良好的机械性能和生物相容性，体外实验表明能够促进间充质干细胞的成骨向分化，为骨缺损的修复提供一种新的思路。