大黄酸对糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用机制

陈亚坤 穆霖 邢玲玲

糖尿病是由多种原因导致机体出现一系列代谢紊乱综合征，疾病本身并不会对患者生命安全造成威胁，但其引起的大血管、微血管病变、神经病变等慢性并发症常是威胁患者生命安全、降低生活质量的主要原因。其中糖尿病肾病是糖尿病常见并发症之一，其根本病理改变为肾脏细胞遭到破坏，导致肾脏功能逐渐削弱、丧失，常以细胞基质病理性聚集为特征性表现[1,2]。炎性反应是诱发并加重肾脏纤维化病情进展的重要原因，在此过程中，炎性因子被激活，造成肾脏细胞发生纤维化[3,4]。大黄酸是从中药大黄中提取，具有抗菌、抗炎、利尿等作用[5]。但笔者发现目前临床关于大黄酸治疗糖尿病肾脏纤维化的相关研究较少，具体的作用机制尚不明确，本研究主要观察大黄酸治疗糖尿病肾脏纤维化大鼠的疗效，以期为未来糖尿病肾脏纤维化的治疗方案开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠50只，购自南京医科大学实验动物管理中心[许可证号： SCXK (苏) 2013-0016]，大鼠均为清洁级SD，周龄为8～14周，平均(11.2±2.3)周；体重0.18～0.27 kg，平均(0.23±0.03)kg。

1.2 药物与试剂制备 大黄酸购自西安昊轩生物科技有限公司，纯度≥98%，采用二甲基亚砜(苏州联雄化工科技有限公司，批号2067B011)充分溶解大黄酸后并稀释，使其浓度<0.01%，经0.22 μm过滤备用，并将0.01%的二甲基亚砜溶液作为空白对照组。高脂高糖饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司；链脲佐菌素购自北京索莱宝科技有限公司，纯度≥98%。

1.3 仪器与设备 采用酶联免疫吸附法检测大鼠转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)抗体、大鼠结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)，CTGF检测试剂盒由上海骨朵生物科技有限公司提供，其余检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；美国贝克曼库尔特商贸有限公司提供的AU5400全自动生化分析仪，酶偶联速率法测定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，采用氨基酸氧化酶法测定血肌酐(serum creatinine，SCr)；选用德国宝灵曼公司Miditron Junior Ⅱ型分析仪及其配套设备，利用尿干化学法检测24 h尿蛋白水平(24-hour urine protein quantification，24hUP)。

1.4 主要方法

1.4.1 建立大鼠模型与分组给药：①建立糖尿病肾病大鼠模型：在购买的50只大鼠中随机抽取10只作为空白对照组，其余40只大鼠建立糖尿病肾病模型，建模成功后随机分为4组，即模型组、低剂量大黄酸组、中剂量大黄酸组、高剂量大黄酸组，每组10只。空白对照组大鼠正常饲养，其余40只大鼠给予高糖饲料喂养10周，将链脲佐菌素以30 mg/kg经腹部注射，注射3 d后，采取大鼠尾静脉血液病检测血糖水平，当血糖水平≥16.7 mmol/L则视为大鼠建模成功。②分组给药：空白对照组：无任何诱导剂；模型组：高糖饲料喂养；低剂量组：高糖饲养+62.5 μg/ml；中剂量组：高糖饲养+125 μg/ml；高剂量组：高糖饲养+250 μg/ml。所有大鼠除了高糖饲养外，其余时间均在同一环境中生长，期间大鼠均自由进食水。

1.4.2 标本处理与采集：给药后，禁食12 h，测量所有大鼠的空腹血糖及24 h尿量，检测大鼠24hUP；采集大鼠股静脉血液，检测BUN、SCr水平；大鼠均给予人性化处死，本研究中全部大鼠的处理均符合《关于善待实验动物指导性意见》[6]中相关意见。

1.4.3 指标检测与方法：①肾功能各指标：采用上述仪器检测大鼠24hUP、BUN及SCr。②TLR4、TGF-β、CTGF水平对比：采用免疫组化法检测TLR4水平:高倍镜下随机抽取10个阳性视野，通过Mocti图像软件分析计算其光密度，并取平均值作为最终水平；采用酶联免疫法检测TGF-β、CTGF水平：将大鼠左肾制作成匀浆，严格按照操作规程分析、计算TGF-β、CTGF水平，并记录对比。③采用 HE染色，普通光学显微镜下观察肾脏组织病理改变

2 结果

2.1 5组肾功能指标比较 相较于空白对照组，4组糖尿病肾病模型大鼠24hUP、BUN、SCr各指标水平均较高，其中高剂量组24hUP、BUN、SCr各指标水平<中剂量组<低剂量组<模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠肾功能指标比较

2.2 5组TLR4、TGF-β、CTGF水平比较 相较于空白对照组，4组糖尿病肾病模型大鼠TLR4、TGF-β、CTGF水平均较高，高剂量组TLR4、TGF-β、CTGF各指标水平<中剂量组<低剂量<模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠TLR4、TGF-β、CTGF水平比较

2.3 5组肾脏HE染色观察 空白对照组显示大鼠肾间质无异常改变以及无纤维组织增生，模型组、高剂量组、中剂量组、低剂组显示大鼠肾小球均有不同程度萎缩、肾间质纤维化增生。病度程度依次高剂量组<中剂量组<低剂组<模型组。见图1。

空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组

3 讨论

肾脏纤维化是因多种原因导致肾功能下降甚至丧失的过程，糖尿病诱发的肾脏纤维化若得不到及时控制，随着病情进展可直接发展为糖尿病肾病[7]。因此，及时控制并阻断肾脏纤维化，对促进患者良性预后具有重要意义。

糖尿病肾病患者机体代谢机制发生紊乱，肾脏固有细胞遭到刺激、破坏，导致炎性细胞分泌增多，并向肾脏浸润，与此同时，细胞分泌的炎性产物导致肾脏固有细胞逐渐发生纤维化，进而导致肾脏向纤维化转变[8]。TGF-β、CTGF属于炎性分泌物，二者之间相互协同，使细胞外基质生成受到抑制，并调节细胞表型，促进成纤维细胞生成，最终造成肾脏纤维化[9]。TLR4属于跨膜蛋白受体家族成员之一，其可通过刺激机体产生免疫应答，当机体血液水平处于持续较高状态时，激活肾小球细胞TLR4抗体，介导免疫反应，进而加重炎症，造成促纤维化因子增加，最终诱发肾脏纤维化[10]。本研究结果显示，干预后，相较于空白对照组，4组糖尿病肾病模型大鼠24hUP、BUN、SCr、TLR4、TGF-β、CTGF各指标水平均较高，其中高剂量组上述各指标水平<中剂量组<低剂量组<模型组。表明大黄酸能够通过改善糖尿病大鼠的肾功能各指标水平，降低炎性因子表达水平。究其原因为大黄酸是中药大黄的主要成分，以其多环节、多成分的优势在机体内发挥重要作用：(1)通过改善肾脏肥大，减少细胞外基质堆积；(2)肾小球细胞增殖受到抑制，进而降低纤维连接蛋白表达水平；(3)降低肾小管上皮细胞的表型转化，阻止间质成纤维细胞由静止期向增殖期转变[11]；(4)拮抗炎性因子产生，抑制细胞内丝分裂原活化蛋白激酶活性，对TGF-β诱导蛋白质合成作用进行拮抗，继而保护内皮细胞[12,13]。

综上所述，大黄酸能够改善糖尿病肾病大鼠的肾功能各指标水平，降低炎性因子表达、改善肾脏纤维化，其中高剂量的大黄酸效果更明显。