社区获得性肺炎并发呼吸衰竭患者外周血SOCS-1、TLR4表达及临床意义

李明旭 朱国清 唐建辉 郁帆 杨志军

社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia CAP)作为临床常见疾病，多发于儿童和老年人，常见临床特征为发热、咳嗽、咳痰、胸痛、乏力等[1]，而呼吸衰竭是其最常见的并发症之一，发生率高达18%～36%[2]。研究显示，CAP患者合并呼吸衰竭后可导致机体严重缺氧、二氧化碳潴留、酸中毒进而导致循环、脑、肾等多脏器功能障碍，严重威胁患者生命健康[3]。及时评估CAP并发呼吸衰竭患者病情和准确评估预后，对提高患者治疗效果有重要意义，现阶段临床评定的常用工具有肺炎严重指数和CURB-65评分，但涉及项目多、操作繁琐，均有一定局限性，因此简单快速、重复性强的检查开展更为重要[4]。细胞因子信号转导抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1，SOCS-1)是免疫应答及炎性反应的重要调节因子，且与肺部疾病有关[5]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一种在免疫反应及非特异性炎症中发挥重要功能的分子[6]。张新黎等[7]研究表明，重症肺炎患者体内TLR4基因表达增加，且与炎性因子呈正相关。二者均与肺部疾病有关，且存在靶向调控作用[8]。因此，本研究主要分析SOCS-1、TLR4在并发及未并发呼吸衰竭的CAP患者外周血单个核细胞中的表达差异，及其在患者病情评价及预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年3月(收治时长放宽至2年)于本院诊治的89例CAP并发呼吸衰竭患者为观察组，其中男49例，女40例；年龄50～76岁，平均(60.34±8.72)岁；平均体重指数(body mass index，BMI)(23.01±2.98)kg/m2。同期选取本院86例CAP但未并发呼吸衰竭患者作为对照组，男51例，女35例；年龄48～78岁，平均(61.04±9.08)岁，平均BMI(22.94±3.02)kg/m2。对入组患者进行急性生理与慢性健康评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)。同时收集记录患者高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史、肺炎严重指数(pneumonia severity index，PSI)等一般资料。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①患者年龄≥18岁；②所有患者符合美国胸科学会关于社区获得性肺炎相关诊断标准[9]；③符合内科学关于呼吸衰竭的诊断标准；④研究符合伦理学标准，经医院伦理委员会审批通过；⑤患者及家属知情同意，其资料齐全并完成最终随访。

1.2.2 排除标准：①有长期(>3个月)或大剂量(>0.5 mg·kg-1·d-1)的类固醇及其他免疫抑制药物使用史者，近5年有器官移植或恶性肿瘤史者；②慢性呼吸衰竭(包括慢性阻塞性肺疾病或其他潜在的慢性呼吸系统疾病)。

1.3 主要试剂与仪器 人外周血淋巴细胞分离液(货号：AP8610)购自上海吉至生化科技有限公司；RNA提取试剂盒(货号：R1200)购自上海雅吉生物科技有限公司；反转录试剂盒(货号：J-SRP1105-100)购自上海研谨生物科技有限公司；qPCR SYBR®Green Mix(货号：11202ES)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。qRT-PCR仪(型号：CFX384)购自美国Bio-Rad公司。

1.4 外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平检测 采集各组受试者入院24 h后空腹静脉血样置于含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中，使用人外周血淋巴细胞分离液将真空采血管中的血样进行单个核细胞分离。提取细胞RNA后将其进行逆转录，之后以常规方式进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)反应实验。qRT-PCR反应体系：cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，qPCR SYBR®Green Mix 10 μl，ddH2O 6.4 μl。每份样品设3个重复孔，GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算单个核细胞中SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA的相对表达量。ΔΔCT=[(待测样本目的基因CT值-待测样本内参基因CT值)-(对照样本目的基因CT值-对照样本内参基因CT值)]。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 治疗方法 2组患者入院后均接受抗感染、止咳化痰、维持水电解质平衡等常规治疗[9]，CAP并发呼吸衰竭患者，根据病情选择鼻导管吸氧、高流量氧疗、无创及有创机械通气等合适的氧疗方式[10]。同时根据观察组患者的生存情况(随访1个月，截止时间为2021年4月)将其分为生存组70例和死亡组19例。

2 结果

2.1 2组一般资料比较 对照组与观察组年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，观察组PSI评分均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组一般资料比较 例(%)

2.2 2组外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分比较 与对照组比较，观察组外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分均较高(P<0.05)。见表3。

表3 2组外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分比较

2.3 观察组不同预后患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分比较 与生存组患者比较，死亡组患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平及APACHEⅡ评分均较高，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 观察组不同预后患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分比较

2.4 观察组SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平与APACHEⅡ评分的相关性分析 Pearson法分析结果显示，观察组SOCS-1 mRNA水平与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.539,P<0.05)，TLR4 mRNA水平与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.613，P<0.05)。见图1、2。

图1 观察组SOCS-1 mRNA水平与APACHEⅡ评分相关性

图2 观察组TLR4 mRNA水平与APACHEⅡ评分相关性

2.5 影响CAP并发呼吸衰竭患者预后的多因素Logistic回归分析 以CAP并发呼吸衰竭患者是否死亡为因变量，排除性别、年龄、BMI、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史、PSI等因素后，以SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及APACHEⅡ评分均是影响CAP并发呼吸衰竭患者死亡的重要因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响CAP并发呼吸衰竭患者预后的多因素Logistic回归分析

2.6 外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA评估CAP并发呼吸衰竭患者预后的价值 以外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及二者联合预测概率值为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA及二者联合评估CAP并发呼吸衰竭患者预后的曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.883(95%CI: 0.793-0.974)、0.878(95%CI: 0.792～0.964)、0.965(95%CI: 0.929～0.998)，且SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA单独评估AUC均小于二者联合评估AUC(Z=1.660、1.830，P<0.05)，特异性分别为80.0%、84.3%、84.3%，敏感度分别为84.2%、78.9%、94.7%。见图3。

图3 SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA评估CAP并发呼吸衰竭患者预后的ROC曲线

3 讨论

CAP是在世界范围内的公共健康问题，具有较高的发病率及死亡率，相关研究表明CAP患者的死亡率居所有疾病死因中的第3位[11]，呼吸衰竭是CAP最严重的并发症之一。CAP并发呼吸衰竭后病情更为复杂、恶化速度加快，且预后凶险病，病死可高达23%～50%[12,13]。及早客观、准确的评估此类患者的病情以及预后，并据此在治疗过程中及时调整治疗方案，有利于临床医师合理分配医疗资源、提高治疗效果。

SOCS是一类细胞内蛋白，其主要作用是参与酪氨酸蛋白激酶-信号转导子和转录激活子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信号通路的负反馈调节[14]。其中SOCS-1在JAK-STAT信号通路中可作为JAK的假底物来调节其催化活性，进而调控信号转导[15]。SOCS-1是一种对细胞因子通路有负性调节的蛋白，能干扰肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等炎性因子的表达，同时也会被各类细胞因子刺激而表达升高[16]。既往研究显示，呼吸道疾病往往使得机体对各类病原菌带来的炎性反应发生免疫应答，进而造成体内细胞因子发生一系列的改变[17]。而本研究结果中并发呼吸衰竭的CAP患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA水平高于未并发呼吸衰竭患者。推测并发呼吸衰竭的CAP患者因呼吸道炎症引发免疫应答，此时机体内细胞因子出现异常变化，而SOCS-1作为JAK-STAT信号通路中重要的负反馈调节蛋白，其表达水平上升，进而发生“瀑布”样级联反应，在炎性反应中发挥重要调控作用。张金仿等[18]研究显示，SOCS-1 mRNA在腺病毒肺炎患儿外周血中升高，且具有临床诊断价值。本研究发现，死亡组并发呼吸衰竭的CAP患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA水平明显高于生存组，SOCS-1 mRNA评估CAP并发呼吸衰竭患者预后的AUC为0.883，特异性和敏感度分别为80.0%、84.2%，且SOCS-1 mRNA与患者APACHEⅡ评分呈正相关。这提示SOCS-1不仅能评估CAP并发呼吸衰竭患者病情程度，而且与预后生存状况有关，并对预后预测有重要价值。

TLR是人体免疫系统中的跨膜受体及病原模式识别受体，其中TLR4与脂多糖作用有关[19]。相关研究显示，TLR4在机体感染及炎症的病理生理过程中，可发挥重要调控作用[20]。本研究结果显示，并发呼吸衰竭的CAP患者及其死亡患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA水平明显较高，且TLR4 mRNA与表征患者疾病严重程度的APACHEⅡ评分具有相关性。提示TLR4 mRNA水平的异常升高可能与并发呼吸衰竭或不良预后有关，推测CAP患者并发呼吸衰竭后，TLR4 mRNA表达上调，催化下游转录因子，诱导促炎细胞因子过度释放，进而加重炎性反应，推动患者病情进展。陈源浩等[21]研究表明，TLR4可评估CAP患儿病情，预测近期预后。而本研究中TLR4 mRNA在评估CAP并发呼吸衰竭患者预后中有重要价值，与SOCS-1 mRNA联合后评估价值有一定的提高，且二者均是影响CAP并发呼吸衰竭患者死亡的重要因素。提示临床中可通过联合检测SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平及早评估患者预后，以便及时调整治疗方案。

综上所述，CAP并发呼吸衰竭患者外周血单个核细胞SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA水平均明显升高，且二者与疾病严重程度均有一定的相关性，可作为评估病情程度的生物指标。此外，SOCS-1 mRNA、TLR4 mRNA联合检测对CAP并发呼吸衰竭预后有重要预测价值，可指导临床诊疗。本研究可为CAP并发呼吸衰竭发病机制的进一步探讨提供一定的实验室依据，有一定的临床价值。但作为单中心、小样本的研究，本实验结果仍需进一步的分析和验证。