大黄素对去势绝经小鼠甘油通道水通道蛋白7表达的组织特异性影响

张仲文 刘志明

围绝经期综合征指的是女性在绝经前后表现出的性激素水平不稳定或者降低而引发身体以及心理出现异常症状[1]。该病症的患者年龄越来越小，且发病率不断上升[2]。现代药理学研究均表明，大黄素具有抗感染、抗肿瘤以及抗病毒的作用，且在临床上的应用范围越来越广泛[3,4]。水通道蛋白7(AQP7)作为脂肪细胞中表达水平最高的一种甘油通道蛋白，其在绝经后的女性内脏脂肪细胞中的水平也增大，而目前有关AQP7在不同组织中的分布研究较少[5,6]。本研究通过构建去势绝经小鼠模型，从而探究大黄素对去势绝经小鼠AQP7表达的组织特异性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验选用11～13个月的C57BL/6雌性健康小鼠50只[购自广东省医学实验动物中心，合格证号：SCXX(粤)2018-0002]，体重为(35±5)g。小鼠随机分笼饲养在室温、相对湿度为(50±5)%的环境中。每天正常喂养小鼠基础饲料并自由饮水。小鼠在适应环境1周后开始实验。已得到实验动物伦理委员会的同意。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：上述50只小鼠随机分为5组，分别为空白对照组、模型组、大黄素低剂量组(0.5 ml/kg)、大黄素中剂量组(1.0 ml/kg)和大黄素高剂量组(2.00 ml/kg)。在制备小鼠饲料时，于基础饲料中分别添加不同水平的大黄素即得低、中和高剂量组所需材料。5组小鼠分笼饲养，除空白对照组，其他4组均构建去势绝经小鼠模型。

1.2.2 去势绝经小鼠模型的构建以及不同脂肪组织的采样：采取浓度为30 mg/kg的戊巴比妥钠对需建模的小鼠做麻醉处理，当小鼠完全麻醉后将双侧卵巢摘除，用浓度为8 000 U/ml的青霉素G钠溶液冲洗腹腔并做缝合处理，在恢复期通过肌内注射青霉素预防伤口发生感染。术后第4天起，用阴道涂片法来确定卵巢是否完全切除[7]。待模型构建成功，麻醉后于股动脉取血，于3 500 r/min的条件下离心处理10 min，分离血清待检。脱颈处死大鼠，迅速打开腹腔，采集性腺脂肪(g-Fat)、腹股沟脂肪(i-Fat)及肾周脂肪(p-Fat)组织置于液氮中，后移至-80℃冰箱中保存[6]。

1.3 观察指标

1.3.1 5组小鼠血清性激素水平比较：根据1.2方法所得血清，按照放射免疫试剂盒相关操作说明测定5组小鼠的血清激素水平，指标包括雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone prog，P)、促卵泡生成素(follicular stimulating hormone，FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)。

1.3.2 5组小鼠卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度比较：在小鼠末次灌胃的24 h之后，称取各小鼠质量，麻醉后脱颈处死，解剖并分离得到子宫和卵巢，将黏附的脂肪和筋膜剔除掉，并使用0.9%氯化钠溶液冲洗干净、滤纸吸干称量子宫和卵巢质量，计算卵巢指数和子宫指数。待称取完毕后将卵巢用浓度为10%的多聚甲醛固定，制成石蜡切片，苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察并测量子宫内膜厚度。其中子宫指数(mg/g)=子宫湿质量/体质量；卵巢指数(mg/g)=卵巢湿质量/体质量[8]。

1.3.3 5组小鼠不同组织中AQP7 mRNA表达水平比较：根据1.2方法所得脂肪组织，匀浆并提取总RNA，调整RNA浓度至1 μg/μl，反转录为cDNA，进行PCR扩增反应。采用2-△△Ct法来测定5组AQP7 mRNA相对表达量，以GAPDH为内参。

1.3.4 5组小鼠不同组织中AQP7蛋白表达水平比较：根据1.2方法所得脂肪组织，提取总蛋白，通过转膜、封闭、一抗孵育以及二抗孵育后加入发光液显色拍照，根据内参标准计算目标条带相对值，采用Western blot法检测各组小鼠AQP7蛋白表达水平。

1.3.5 5组小鼠雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平比较：通过Trizol法提取各组小鼠卵巢和子宫组织的总RNA，参照反转录试剂盒说明反转录为cDNA，按照RT-PCR法测定组小鼠雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平。

1.3.6 血清性激素对小鼠模型AQP7表达的影响：根据1.2.1、1.2.2和1.2.3结果，分析血清性激素对小鼠模型AQP7表达的影响。

2 结果

2.1 5组小鼠血清性激素水平比较 与空白对照组比较，其余4组小鼠E2和P水平均降低，FSH和LH的水平均升高，且模型组最为显著(P<0.05)。除空白对照组外，其余3个药物组与模型组比较，E2和P水平均升高，FSH和LH水平均降低(P<0.05)；大黄素高剂量组对小鼠血清性激素水平的影响幅度显著高于中、低剂量组(P<0.05)，中剂量组的影响又显著高于低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 5组小鼠血清性激素水平对比分析

2.2 5组小鼠卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度比较 与空白对照组比较，其余4个组小鼠卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度均减小，且模型组最为显著(P<0.05)。除空白对照组外，其余3个药物组与模型组相比，卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度均增大(P<0.05)；大黄素高剂量组对卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度影响幅度显著高于中、低剂量组(P<0.05)，中剂量组的影响又显著高于低剂量组(P<0.05)。见图1，表2。

空白对照组模型组大黄素低剂量组大黄素中剂量组大黄素高剂量组

表2 5组小鼠卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度对比分析

2.3 5组小鼠不同组织中AQP7 mRNA表达水平比较 与空白对照组比较，其余4个组小鼠不同组织中AQP7 mRNA均增大，且模型组最为显著(P<0.05)。除空白对照组外，其余3个药物组与模型组比较，不同组织中AQP7 mRNA水平增加明显(P<0.05)；大黄素高剂量组对不同组织中甘油通道水通道蛋白7 mRNA影响幅度显著高于大黄素中、低剂量组(P<0.05)，大黄素中剂量组的影响又显著高于大黄素低剂量组(P<0.05)。见表3。

表3 5组小鼠不同组织中AQP7 mRNA表达水平比较

2.4 5组小鼠不同组织中AQP7蛋白表达水平比较 与空白对照组比较，其余4个组小鼠不同组织中AQP7的蛋白水平均增大，且模型组最为显著(P<0.05)。除空白对照组外，其余3个药物组与模型组比较，不同组织中AQP7的蛋白水平增大(P<0.05)；大黄素高剂量组对不同组织中AQP7的蛋白影响幅度显著高于中、低剂量组(P<0.05)，中剂量组的影响又显著高于低剂量组(P<0.05)。见表4。

表4 5组小鼠不同组织中AQP7蛋白表达水平比较

2.5 5组小鼠雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平比较 与空白对照组比较，其余4个组小鼠雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平均减小，且模型组最为显著(P<0.05)。除空白对照组外，其余3个药物组与模型组比较，雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平均增大(P<0.05)；大黄素高剂量组对雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平影响幅度显著高于中、低剂量组(P<0.05)，中剂量组的影响又显著高于低剂量组(P<0.05)。见表5。

表5 5组小鼠雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平比较

2.6 血清性激素对小鼠模型AQP7表达的影响 直线相关与回归分析表明，血清性激素与小鼠模型g-Fat和p-Fat中的AQP7表达呈正相关(P<0.05)，i-Fat中的AQP7表达与FSH呈负相关(P<0.05)。见表6。

表6 血清性激素对小鼠模型AQP7表达的影响

3 讨论

临床研究表明，患有围绝经期综合征的女性，由于其卵巢功能出现衰退以及雌激素水平降低而导致一系列的神经系统功能紊乱[9,10]。AQP7是脂肪细胞中最主要的甘油通道蛋白，与肥胖的发生存在密切的相关性，而患有围绝经期综合征的女性就伴有肥胖[11-13]。目前，有关该病症的治疗大多通过药物或者激素给予干预，大黄素是一种具有补益精血、强壮筋骨以及强健肝肾功能的良效，该物质的出现给围绝经期综合征的治疗提供了新的转机，但作用机制目前尚不明确。

FSH、LH、E2和P四种激素主要是促进卵巢中卵泡的发育以及成熟[14,15]。当女性进入围绝经期后，卵巢功能就会出现较大的衰退，卵巢内分泌功能也显著降低，因此雌激素分泌的水平出现减少，导致FSH和LH的水平变大，E2和P则降低，抑制了卵泡的发育和卵子的生长[16]。本研究结果发现，去势绝经小鼠较健康小鼠的E2和P的水平均降低，FSH和LH的水平均升高；当对去势绝经小鼠给予大黄素后，E2和P水平均升高，FSH和LH水平则降低(均P<0.05)。

子宫指数和卵巢指数作为评价雌激素水平效应的关键指标，指数的变化与雌激素水平呈现正相关[17,18]。本研究结果发现，与健康小鼠比较，去势绝经小鼠的卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度均减小；当对去势绝经小鼠给予大黄素后，卵巢指数、子宫指数和子宫内膜厚度则均增大(P<0.05)。

激素在体内的活性变化是通过相应的受体进行介导的，然而激素受体功能能否正常发挥又会受到调节因子以及受体基因转录水平等的影响[19,20]。雌激素在发挥相应的生理作用时主要是受到ERα和ERβ受体介导的。本研究结果发现，与健康小鼠比较，去势绝经小鼠的雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平均减小；当对去势绝经小鼠给予大黄素后，雌激素受体基因ERα和ERβ mRNA水平均增大(P<0.05)。

在本研究中，去势绝经小鼠的g-Fat、i-Fat以及p-Fat组织中的AQP7的mRNA和蛋白表达水平均显著增大，表明AQP7参与调节去势绝经小鼠的脂质堆积；当用大黄素进行干预后，AQP7的mRNA和蛋白表达水平则降低。另外，本研究还发现，血清性激素与小鼠模型g-Fat和p-Fat中的AQP7表达呈正相关，而i-Fat中的AQP7表达与FSH呈负相关，提示AQP7在去势绝经小鼠体内的表达具有组织特异性，且AQP7的表达水平受到了雌激素的影响，而大黄素则会通过影响雌激素水平从而干预AQP7的表达。

综上所述，大黄素能够通过改善去势绝经小鼠的血清性激素水平从而降低不同组织中甘油通道水通道蛋白7的表达，对小鼠卵巢和子宫有保护作用。