液相色谱-单四级杆法检测奶粉中泛酸的应用

徐 旖，王荣艳，陈青俊，任一平

1 浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310051

2 浙江清华长三角研究院，浙江嘉兴 314000

0 引言

泛酸又称为维生素B5，是一种水溶性维生素，外观颜色呈浅黄，因广泛存在于动植物中而得“泛酸”之名（图1）。泛酸的一个重要作用是以乙酰辅酶A形式参加代谢过程，是二碳单位的载体，也是体内乙酰化酶的辅酶，是酰基的传递者。我国对奶粉中的泛酸使用量有一定的标准要求，为6~80 mg/kg[1]，特殊医学食品中对泛酸使用量也有要求[2]，因此为了保证奶粉的质量，必须加强泛酸含量的检测。

图1 泛酸结构式

目前，食品中泛酸的国家标准检测方法是微生物法和高效液相色谱法[3]。微生物法[4，5]是测定泛酸的经典方法，但操作复杂且费时，属于半定量方法。高效液相色谱法[6~12]常用于强化食品中泛酸的检测，其流动相为磷酸盐缓冲溶液，需精准地调节溶液pH值，不但过程复杂，且200 nm检测波长易受到其他营养添加剂的干扰；随着水解乳清蛋白原料在婴幼儿食品中的开发利用，高效液相法测试泛酸的预处理过程中，水解的蛋白肽无法被硫酸锌沉淀去除，色谱柱的分离能力有限，使现行国标[3]在测定特殊医学配方和基质复杂样品时常常遇到杂质色谱峰干扰的问题（图2），因此该标准方法面临修订的需求。此外，免疫法、高效毛细管电泳法、气相色谱-质谱联用法、超临界流体色谱法等[13~17]由于仪器价格昂贵、操作复杂而难以普及。

图2 液相色谱法-色谱峰干扰图

液相色谱-单四级杆检测法具有较高的灵敏度和较强的排除干扰能力，可快速测定较低含量且基质复杂的样品，具有操作简单、仪器价格相对低的优点。本文采用泛酸-[13C6，15N2]作为泛酸分析的内标物，液相色谱-单四级杆（色谱）联用Arc-QDA系统，HSS T3反相色谱柱分离，单四级杆检测器，有效排除了液相色谱-紫外检测器方法测定特殊医学配方样品存在的色谱峰干扰问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泛酸钙（纯度≥99.0%），Sigma公司；泛酸-[13C6，15N2]（纯度99.4%），Be Pure公司；甲酸（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸铵（色谱纯）、水系滤膜0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器设备

四元梯度高压液相-单四级杆（色谱）联用仪、Acquity HSS T3色谱柱 Waters公司；3K15型高速冷冻离心机，Sigma公司；ST 3100型pH计、AR224CN型电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品配制

泛酸标准溶液（100 μg/mL）：称取泛酸钙10.78 mg，加水溶解至100 mL容量瓶，4 ℃保存。

泛酸同位素标准溶液（50 μg/mL）：称取泛酸-[13C6，15N2] 5 mg，加水溶解至100 mL容量瓶，4 ℃保存。

1.3.2 样品处理

称取样品约5 g（精确至0.001 g）至100 mL锥形瓶中，加25 mL温水溶解，加入3 mL同位素内标溶液。如果试样中含有淀粉，加入淀粉酶0.2 g，振摇混匀，盖上瓶塞，在（55±5）℃水浴条件下，振摇酶解120~240 min；如果试样不含淀粉，直接超声15 min。放置室温，用盐酸溶液调节pH至5.0±0.1，加入5 mL硫酸锌溶液，混匀。转入50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，转入2 mL离心管15 000 r/min离心5~10 min，取上清液过0.45 μm滤膜。吸取0.5 mL滤液用水稀释并定容至5 mL容量瓶，待上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL。流动相A：10 mmol/L甲酸铵（含0.5%甲酸）溶液，流动相B：甲醇。梯度洗脱条件：0~1 min，95%A；1~4 min，5%~100%B；4~5 min，100%B；5.1~10 min，95%A。

1.3.4 质谱条件

电离模式：ESI+；监测方式：单离子选择（SIR）；毛细管电压：800 V；离子源温度：122 ℃；喷针温度：600 ℃；质谱监测条件见表1。

表1 质谱检测条件

1.4 结果计算

试样中泛酸含量计算公式如下：

式中：X为泛酸含量（mg/100 g）；c为从标准曲线上得到的泛酸浓度（μg/mL）；V为样品定容体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

本方法比较了C18色谱柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）、BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、BEH C8色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）和HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）的分离效果（图3）。试验结果显示，泛酸在BEH C18、BEH C8色谱柱上的保留较差，易受到样品中杂质的干扰。而在C18色谱柱和HSS T3色谱柱上得到了较好的分离效果，响应值高，但C18色谱柱的峰型较差，本试验选用HSS T3柱。

图3 泛酸在4 种色谱柱上的色谱图

2.2 流动相的选择

分别采用10 mmol/L甲酸铵（含0.05 %甲酸）、10 mmol/L甲酸铵（含0.1 %甲酸）、10 mmol/L甲酸铵（含0.5 %甲酸）和甲醇、乙腈作为流动相，以不同流速和梯度进行洗脱（图4）。结果表明，选用10 mmol/L甲酸铵（含0.5 %甲酸）和甲醇梯度洗脱，泛酸分离效果和响应较好。

图4 泛酸在4种流动相中的色谱图

2.3 基质干扰的评估

鉴于很难在现有样品中找到泛酸阴性的基质，本试验选择市售羊奶粉、特殊医学配方奶粉（含水解蛋白）、普通牛奶粉作为基质干扰的评估样品：对上述3 种基质奶粉分别稀释0 倍、1 倍、2 倍、5倍、10 倍、20 倍，再加入相同浓度的同位素内标，进样测定，结果见图5。图中依据稀释倍数为横坐标，内标峰面积为纵坐标绘制了曲线，同时与水溶内标液的峰面积作比对。

图5 基质干扰图

以水溶液作为基质参考，羊奶粉与普通奶粉基质干扰明显较低，而特殊医学配方奶粉有明显增益作用。在1~20 倍稀释后趋近平稳。由此可见，特殊医学配方奶粉样液基质干扰严重，在试样中加入用同位素内标可有效排除基质干扰所导致对结果的影响。

2.4 线性范围、检出限和定量限

准确吸取泛酸标准溶液，分别添加泛酸同位素标准溶液，用水稀释成50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL、800 ng/mL、120 0 ng/mL的泛酸标准工作液，以锋面积比（A1泛酸/A2同位素）和同位素质量浓度的乘积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，泛酸在5.0～120.0 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为Y=1.407 48X＋0.002 840 6，相关系数（R2）=0.999 96。根据离子信噪比（RSN）确定检出限（RSN≥3）为0.423 ng/mL，定量限（RSN≥10）为1.41 ng/mL。当取样量为5 g，检出限和定量限分别为0.004 23 mg/100 g和0.014 1 mg/100 g。低于国标方法的检出限（0.025 mg/100 g）和定量限（0.08 mg/100 g）。

2.5 加标回收试验

取3 种不同基质的奶粉样品，分别进行3 个标准添加水平的回收率试验，每个添加水平重复测定3次，分别计算加标回收率，结果见表2。

表2 泛酸加标回收测试结果

泛酸3 个水平的加标回收率在90.3%～104.5%，相对标准偏差在0.42%～2.80%，能够满足检测实际样品需要。

2.6 方法稳定性

分别取特殊医学配方奶粉（含水解蛋白）、普通牛奶粉样品，按照1.3的方法，分别做11 个平行，考察方法的精密度，结果见表3。

表3 泛酸方法精密度

由表3计算出11 个特殊医学配方奶粉（含水解蛋白）样品平均含量为6.49 mg/100g，相对标准偏差0.28%；11 个普通牛奶粉样品平均含量为4.62 mg/100g，相对标准偏差0.06 %。

2.7 与《GB 5009.210—2016食品国家标准食品中泛酸的测定》第二法的结果比对

用《GB 5009.210—2016食品国家标准 食品中泛酸的测定》第二法液相色谱法和单四级杆质谱法同时对羊奶粉、特殊医学配方奶粉（含水解蛋白）、牛奶粉样品做比对试验（表4）。

表4 与《GB 5009.210—2016食品中泛酸的测定》第二法结果比对（n=3）

经试验，单四级杆质谱法检测羊奶粉与牛奶粉的泛酸含量与国标中《GB 5009.210—2016 食品国家标准食品中泛酸的测定》第二法 液相色谱法的检测结果差异不明显。从图6中可看出，《GB 5009.210—2016 食品国家标准 食品中泛酸的测定》第二法 液相色谱法测定特殊医学配方奶粉时受杂峰干扰严重，杂峰无法与目标峰分开甚至与目标峰重合，且结果不稳定，平行性差。而单四级杆质谱法成功解决杂质的干扰，其结果与商品包装的明示含量一致。

图6 样品中泛酸色谱图

3 结论

本文建立了液相色谱-单四级杆测定婴幼儿食品中泛酸的方法，相对于高效液相色谱法，本法有效地排除了水解蛋白对泛酸定量检测中对目标峰的干扰。完全可满足现有各类配方食品（包括特殊医学配方奶粉、羊奶粉等不同基质）中泛酸含量的检测；方法具有灵敏度，稳定性好操作简单等优点。由于样品处理简单，分离时间短，大大地缩短了整个测试时间，提高了工作效率；液相色谱-单四级杆仪比液相色谱-三重四级杆仪，具有仪器价格便宜，分析操作简单，更利于在企业（基层）试验室推广应用。但该仪器采用单离子采集方式，较三重四级杆灵敏度低，故本方法不能满足天然食品中低含量泛酸的测定。该方法在选定的色谱条件下，对泛酸分离效果好，方法重现性好、回收率高，可作为特殊医学配方食品、婴幼儿食品中泛酸含量检测的优选方法。