超高效液相色谱—串联四极杆质谱检测南瓜子中泛酸的含量

张鹤+赵飞+高广慧

摘 要：本文采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱检测南瓜子中泛酸含量的方法，并进行了方法学验证。样品经а-淀粉酶酶解后，调节提取液的pH值，沉淀蛋白后，经石油醚除油后，采用ACQUITY UPLC C18（50mm×2.1mm，1.7μm）色谱柱梯度洗脱分离，用超高效液相色谱电喷雾离子源串联四级杆质谱检测，可在2.5 min内完成一批次待测液的检测。泛酸在0.05-5 μg/mL范围内有良好的线性，相关系数大于0.999，回收率在97.8 %～107 %之间，相对标准偏差为2.5 %～6.0 %。研究结果表明，该方法简便、快速、准确，可快速检测南瓜子中泛酸的含量。

关键词：泛酸；超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱；南瓜子

中图分类号：D919 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）11-0041-03

随着科学技术的不断进步和经济的不断发展，人们的饮食文化也呈现多样化发展的趋势，对于食品的摄入不仅要求健康安全，同时要求食物带来更多的营养补充。维生素是人体必须的营养成分，因此全面建立食品中维生素的检测方法显得尤为重要。

泛酸又称“遍多酸”，是维生素B族的一种。它广泛存在于多种干果食品中。目前泛酸的检测方法主要有高效液相色谱法、微生物法。国家标准中对保健食品、婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸的检测采用高效液相色谱法，其余食品中泛酸的检测采用GB/T 5009.210-2008微生物法，没有理化检测方法，因此本研究中以南瓜子为例，建立了南瓜子中泛酸的检测方法，意在为食品加工和生产领域选择原材料及优化加工流程提供支持；同时可为检验机构进行干果及其制品中泛酸检测做参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC-Xevo TQD型超高效液相色谱串联质谱联用仪、BEH C18 1.7μm 2.3×50mm色谱柱 美国WATERS公司；高速冷冻离心机美国Thermo公司；涡旋混合仪 德国IKA公司；分析天平德国Sartorius公司。

标准物质：泛酸钙（纯度>98.0%）美国SUPELCO公司；

甲酸（色谱纯）美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）美国Fisher公司；а-淀粉酶（生物试剂）AOBOX公司活度3.7U/mg；盐酸（分析纯） 北京化学试剂研究所；硫酸锌（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；石油醚（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为一级水。

1.2 标准溶液的配制

精密称取泛酸钙标准物质适量，用水溶解并定容至10mL，配制成1.0mg/mL标准溶液。

1.3 样品前处理

分别准备未经加工处理和经加工处理的南瓜子若干。未经加工处理的南瓜子是由超级市场购买的南瓜中取出南瓜子，并经洗净、晾干、去皮处理，经加工的南瓜子购于超级市场，并经去皮处理，并于粉碎机中粉碎均匀。

称取粉碎均匀的南瓜子样品5g（精确至0.0001g）于50mL离心管中，向离心管中依次加入0.2gа-淀粉酶、20mL40-50℃温水，涡旋半分钟后，置于50-60℃水浴中震荡酶解40min，待酶解完成放至室温，用盐酸溶液调节酶解液的pH值至4.5±0.1，向其中再加入5mL硫酸锌溶液，静置30min，5000r/min离心10min，将上清液转移至另一50mL离心管，用水定容至30mL。向离心管中加入10mL石油醚（沸程为30-60℃），涡旋半分钟，静置分层，弃去上层，下层重复上述操作两次，下层清液稀释10倍后，经0.22μm滤膜过滤至棕色进样瓶中待测。

1.4 UPLC色谱条件

色谱柱：C18 1.7μm 2.1×50mm；柱温：30℃；样品室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：A相：乙腈、B相：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱条件见表1。

1.5 MS/MS质谱条件

电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；毛细管电压2.0KV；离子源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；锥孔气流量50L/h；脱溶剂气流量800L/h。泛酸的定量和定性离子对、锥孔电压和碰撞能量参数见表2。

2 结果与讨论

2.1 线性关系及相关系数

实验结果表明泛酸浓度在0.05-5μg/mL范围内与其定量离子对的峰面积响应值具有良好的线性关系，回归方程为y=42552x+1796.3，相关系数为0.9991。

2.2 方法精密度与样品溶液稳定性

取回收率试验一点每日连续进样6次，检测3次，测得结果见表3，结果符合分析要求，方法精密度良好，处理后的样品溶液在室温避光放置4天对测定结果无影响。

2.3 回收率

取已知含量的南瓜子样品，进行三个标准添加水平（分别向样品中添加相当于泛酸0.3、0.6、0.9mg的标准溶液）的回收率实验，每个回收率添加水平平行进行6份，分别计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表4。泛酸的三个水平加标回收率在97.8-107%，相对标准偏差在2.5-6.0%，满足实际样品分析需求。

2.4 实际样品检测

分别将粉碎均匀的经加工和未经加工的南瓜子按照本文建立的方法进行预处理并且测定，计算结果见表5。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理的优化

南瓜子样品含有大量蛋白质、脂肪，同时含有淀粉，为使处理得到的待测液杂志含量较低、干扰较少，本文中针对不同的杂质采用了不同的除杂方法。先后加入了淀粉酶、硫酸锌溶液、调节待测液pH值、石油醚，分别分解样品中的淀粉、除蛋白质、除脂肪，效果较好。

3.2 色谱条件优化

分别采用乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相，检测同一浓度标准溶液，结果显示加入甲酸的流动相因甲酸的存在使得待测液中泛酸的离子化效率更高，响应更好，因此选择后者作为流动相。同时调整了流动相梯度洗脱程序，获得较好的峰形和响应值。

3.3 质谱条件的优化

本方法采用质谱直接进样，查找定性定量离子对的方式，分别优化了锥孔电压、碰撞电压、脱溶剂气流量、锥孔气流量等条件，最终确定条件见表。

4 取得成果及创新点

通过研究建立了超高效液相色谱串联质谱联用仪检测南瓜子中泛酸含量的方法，并用该方法检测了经加工和未经加工的南瓜子中泛酸的含量。该法准确度高，精密度好，为食品中泛酸含量的检测提供了技术支持。本研究的创新点及取得的成果主要有以下几方面：

（1）建立了南瓜子中泛酸检测的样品前处理方法，通过查阅文献资料，我们发现食品中泛酸的检测除嬰幼儿食品和乳品可采用微生物法和高效液相色谱法外，其余均使用微生物法。而本研究建立的方法采用超高效液相色谱串联质谱，多反应离子监测方式大大提高了选择性和灵敏度，该法重现性好，处理操作简单。

（2）本研究采用串联四极杆质谱检测南瓜子中泛酸的含量，通过定性离子与定量离子的丰度比对检出成分进行定性确证，再通过定量离子的响应强度对样品中泛酸的含量进行定量分析。此法较液相色谱法通过保留时间进行定性更为准确可靠，选择性更高；同时采用多反应离子监测，使得灵敏度更高。

参考文献

[1]渠岩，崔亚娟，李全霞等.超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定配方奶粉中的泛酸[J].食品科学，2014，08（35）：212-216.

[2]李洪燕，李秀英，陈俊禧，等.同位素稀释-超高压液相色谱-串联质谱法测定维生素营养液中的泛酸含量[J].食品安全质量检测学报，2015，4（6）：1504-1510.

[3]何敏恒，李秀英，曾令浩，等.同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中泛酸含量[J].中国酿造，2015，4（34）：157-160.

[4]远辉，袁辉，孙蕾.高效液相色谱法测定新疆薄皮核桃和开心果中泛酸的含量[J].食品工业，2009，7（36）：279-281.