生育酚氧化产物生育酚醌的研究进展

郑立友，莫妮娜，胡秀秀，贾惠婷，王 政，谢亮亮，谢 丹，金 俊，金青哲，郭红艳

(1.安徽工程大学 生物与食品工程学院，安徽 芜湖214000； 2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

植物油脂富含生育酚，但不同种类的植物油脂所含生育酚的类型和含量大不相同[1]。生育酚醌(TQ)是生育酚的主要脂质过氧化代谢物，其在生物系统中具有抗菌活性[2]、抗氧化活性[3]、选择性细胞毒性[4-7]等多种作用，近年来逐渐受到关注，其有4种主要结构：α-TQ、β-TQ、γ-TQ、δ-TQ(见图1)。

图1 生育酚醌(TQ)的主要结构

TQ是一类潜在的食品安全危害因子。研究表明，因α-TQ中六元环被完全取代，不具有芳基化活性，而β-TQ、γ-TQ、δ-TQ由于六元环未被完全取代，具有芳基化活性，因而具有一定的细胞毒性[8-9]。相较于生育酚研究的深度及广度，TQ的研究起步较晚，相关研究亟待开展。目前植物油脂经常用于加热使用(微波、烘箱和煎炸等过程)，势必会有TQ的生成。因此，本文归纳总结了TQ的检测、食品加工中TQ的生成规律影响因素及其毒性和抗氧化等方面的研究现状，进而指出了现阶段研究存在的问题，并提出了TQ研究的发展方向，旨在为充分研究TQ提供一定的研究基础参考，避免丙烯酰胺、氯丙醇酯等类似食品安全事件的再次发生。

1 生育酚醌的检测方法

1.1 液相色谱法

因液相色谱无需进行样品衍生化处理，样品预处理相对简单，因此其被广泛应用于生育酚及其醌类物质的检测。目前主要采用甲醇/乙腈-水为主要流动相的反相液相色谱系统进行生育酚及其醌类化合物的检测分析，如：Kruk等[10]通过反相高效液相色谱系统RP-HPLC，配备荧光检测器，发射波长290 nm，吸收波长330 nm)，配合锌柱柱后衍生技术测定衣藻提取物中的α-TQ和γ-TQ的含量，发现两者含量受植物生长环境及生长阶段的影响较大；Kreps等[11]采用正相色谱同步测定生育酚单体(α-、β-、γ-、δ-生育酚)和总醌的含量，同时采用RP-HPLC梯度洗脱条件下测定γ-TQ。

目前，高效液相色谱质谱联用作为物质高效分离检测手段，已开始用于测定生育酚及其氧化产物TQ等[12-13]。前期本文作者通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)分别检测并鉴定了生育酚及TQ等物质[14]，后续将进一步优化色谱条件，建立同步检测的方法。

目前液相色谱配备紫外检测器(HPLC-UV)应用最为广泛，随着检测手段及检测技术的升级，液质联用法将更为普及。本文主要列举了部分有关TQ和生育酚的液相色谱测定方法，具体参数如表1所示。

表1 HPLC测定TQ的分析检测方法

续表1

1.2 其他方法

薄层色谱法也被用于TQ的分离检测[25]。另外，也有学者采用气质联用检测TQ，如Melchert等[26]采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20) 进行样品预处理、预分离，并采用GC-MS进行TQ(游离型和硅烷化型)含量的测定，在全扫描模式下，检测限和定量限分别为1 μL进样体积含有1 ng和10 ng物质，达到了较好的定量定性效果。

2 食品中生育酚醌生成规律影响因素

TQ主要在富含生育酚的植物油脂加热过程中形成，其中150～220℃为其生成的最佳温度；加工温度较低，TQ的含量较低。因植物油脂中生育酚单体含量差异较大，热加工过程中产生的TQ构成(种类及含量)也有较大的差异。

首先，温度是影响TQ生成的主要因素。Murkovic等[27]通过加热强化α-生育酚的玉米油时发现:90℃下α-TQ含量随加热时间的延长(0～11 h)逐步增加，在11 h时α-TQ含量高达130 mg/kg；180℃下加热7 h，α-TQ含量高达275 mg/kg，而后含量趋于稳定；220℃下α-TQ生成速率最快，加热1 h其含量已达到150 mg/kg，但由于该温度下α-TQ不稳定，随着加热时间的延长，其含量呈逐步下降的趋势，这也与文献[23]报道的结果相一致。Verleyen等[21]研究表明，脂质模拟体系中α-生育酚在高温煎炸(150～250℃)下发生热氧化反应生成α-TQ。一般情况下，同一温度下，随着加热时间(一定范围内)的延长，TQ的含量逐渐升高，但温度过高会导致TQ含量降低。可见，不同温度下，α-TQ生成规律不一。

其次，油脂基质中生育酚的初始含量也是影响TQ生成的因素之一。Rennick等[22]通过180℃加热葵花籽油和大豆油发现:未添加α-生育酚情况下，加热葵花籽油5 h和10 h，α-TQ含量分别增加至87 mg/kg和104 mg/kg，加热大豆油5 h和10 h，α-TQ含量分别增加至29 mg/kg和53 mg/kg；添加α-生育酚的情况下，加热葵花籽油5 h和10 h，α-TQ含量分别增加至127 mg/kg和164 mg/kg，加热大豆油5 h和10 h，α-TQ含量分别增加至159 mg/kg和187 mg/kg。可见，基底中生育酚含量越高，随着生育酚的消耗，一定条件下TQ的生成量也就越多。

再次，氧化条件也对TQ的生成有较大影响。Kreps等[25]通过Rancimat加速氧化葵花籽油(180℃)发现:通空气加热2 h后α-TQ的含量达到最大值150 mg/kg，但同时在加热过程中因α-TQ不稳定发生降解，加热2～10 h其含量呈下降趋势；而不通空气情况下，α-TQ含量在整个加热过程中呈逐渐增加的趋势。可见，加速氧化会加速TQ的生成。

最后，加热方式也显著影响TQ的生成规律。Kreps等[11]研究了微波加热对TQ生成的影响，发现微波可加速TQ的生成，微波加热菜籽油10 min即可生成 8 mg/kg的γ-TQ。另外，其研究了煎炸方式(浅表煎炸、深度煎炸)对煎炸油中TQ生成规律的影响，发现浅表煎炸产生的TQ显著高于深度煎炸产生的量。同时,对γ-TQ的空间分布情况研究发现，浅表煎炸50 min内，菜籽油生成了22 mg/kg 的γ-TQ，其中5～7 mg/kg的γ-TQ转移至煎炸食品薯条中，而深度煎炸50 min，菜籽油中仅产生了6 mg/kg的γ-TQ。

3 生育酚醌的毒性

TQ具有一定的毒性，但具有两面性。Lindsey等[28]发现在生物体系内(平滑肌细胞增殖培养过程)脂质过氧化中γ-TQ 具有高细胞毒性(细胞铺满培养阶段，10～25 μmol/L；细胞增殖阶段，1～10 μmol/L)，实验中观察到可引起细胞的凋亡。在此研究结果基础上，Thornton等[4]进一步研究发现，γ-TQ、δ-TQ均呈现一定的细胞(平滑肌细胞)毒性，诱发细胞有丝分裂，并呈剂量依赖性，且γ-TQ毒性更强。与此同时，γ-TQ对药物敏感的急性淋巴细胞白血病细胞系(CEM)和多重耐药淋巴细胞白血病细胞系(CEM/VLB100)也具有高细胞毒性，并推测γ-TQ毒性可能源于Michael加合物生成。Cornwell等[29]研究发现，α-TQ无细胞毒性，而γ-TQ、δ-TQ在CEM 和CEM/VLB100均具有高细胞毒性(LD50<10 μmol/L)，且γ-TQ、δ-TQ相较于阿霉素(一种抗肿瘤药物)具有更高的细胞毒性，同样对CEM细胞具有选择性细胞毒性。γ-TQ、δ-TQ属于亲核烷基化试剂，可生成Michael加合物和醌甲基类似物，烷基化反应是亲核醌类物质致毒性的原因所在。Jones等[30]研究发现，γ-TQ对损伤细胞膜、活细胞数量的减少和凋亡激活等表现出浓度和时间依赖性的影响。进一步研究发现，γ-TQ引起WiDr结肠腺癌细胞、HL-60白血病细胞和小鼠胸腺瘤细胞的凋亡主要源于其调控了参与凋亡级联反应的不同蛋白的表达，如细胞色素C的释放和凋亡Caspase复合体形成[31-32]。由于γ-TQ、δ-TQ属于芳基化醌类化合物，Wang 等[33]研究进一步指出芳基化醌类毒性机制主要源于Michael加合物生成和内质网应激反应，而非仅仅源于Michael加合物生成。另外，也有研究发现TQ显著抑制雄激素反应性前列腺癌细胞增殖、雄激素受体活性和雄激素受体蛋白表达[34]。

因TQ对人急性淋巴母细胞白血病和早幼粒细胞白血病细胞具有强大的细胞毒性作用和诱导凋亡、逃脱耐药性的特点，在医学肿瘤的治疗方面赋予了其作为强效化疗剂的潜力[32]，这也与醌类物质具有一定的抗癌、抗肿瘤活性相一致。

4 生育酚醌的抗氧化活性

近年来，随着对醌类物质认识和研究的深入，不少学者对醌类物质的抗氧化活性也进行了相关研究[35-37]。现阶段关于TQ的抗氧化活性有体内和体外研究，主要集中于体外研究。Bindoli等[38]研究发现，α-TQ可抑制脂质体中抗坏血酸/Fe2+诱导的脂质过氧化。Lindsey等[28]研究发现：在非生物模拟体系中，α-TQ的抗氧化活性与α-生育酚、γ-生育酚的抗氧化活性差异不显著，而γ-TQ则在低浓度(1～100 μmol/L)下表现出抗氧化活性，而在高浓度(1 000 μmol/L)则表现出促氧化作用；在生物体系内(平滑肌细胞增殖培养过程)脂质过氧化中，α-TQ、α-生育酚、γ-生育酚的抗氧化活性也无显著差异。Thornton等[4]进一步研究发现，模拟体系中α-TQ、γ-TQ、δ-TQ均在低浓度(1～10 μmol/L)下表现出抗氧化活性，而在高浓度(10～1 000 μmol/L)则表现出促氧化作用，且同样浓度下γ-TQ的促氧化作用强于α-TQ、δ-TQ。与此同时，在平滑肌细胞培养过程中低浓度(1～50 μmol/L)的α-TQ、γ-TQ、δ-TQ均为抗氧化剂。Siegel等[39]研究发现，醌氧化还原酶可在细胞中将α-TQ还原成氢醌(TQH2)，进一步研究发现人体内α-TQ是一种有效的抗氧化剂，主要源于其可阻碍辅酶Q的电子转移，此外，α-TQ也可被微粒体及线粒体中的酶还原生成TQH2，其抗氧化效果进一步增强[40]。

为更为全面客观地评价TQ的抗氧化活性，学者对TQ的体内抗氧化模型进行了研究。研究表明，α-TQ具有阿尔茨海默病(AD)的治疗前景[41-42]。AD的病理变化与可溶性β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体、神经炎症和氧化应激有关。Yang[5]、Wang[43]等在前期体外研究发现α-TQ能够抑制Aβ的聚集，减少Aβ诱导的细胞毒性的基础上，进一步研究了α-TQ的体内作用，发现α-TQ可使可溶性Aβ寡聚体的水平明显降低，抑制NF-κB信号通路活化，减少AD小鼠的炎症病理反应，降低AD小鼠的氧化应激水平，进而可有效阻遏阿尔茨海默病的产生与恶化。可见，TQ也具有一定的体内抗氧化活性，值得进一步挖掘开发。

5 结 语

近年来，人们对生育酚的检测及性质做了广泛的研究，但国内对于TQ的研究尚未开展系统性报道。TQ是一类潜在的食品安全危害因子，但其又有一定的抗癌、抗氧化活性。有关TQ相关研究尚存在以下问题：①目前各TQ单体的定量检测存在一定的困难，主要源于标准品的缺失。虽然有市售的α-TQ，但其他单体物质仍需要实验者自行合成再去定量，缺乏标准物质，也就缺乏了物质定量的准确性和统一性。因此，各TQ单体的制备需要进一步规范化。②因油脂加工方法和油脂烹调方式多样，生育酚向TQ转化的规律需进一步系统研究，包括油脂脱臭阶段高温下TQ的生成情况，煎炸油煎炸不同种类食品(薯条、鸡块等)时，TQ的生成、迁移及空间分布情况等，以及抑制TQ在植物油脂中的生成量及向食品迁移量的方法。③各TQ单体的毒性等研究需进一步扩展，如采用体内实验(如秀丽线虫模型或斑马鱼模型等)更为全面地研究TQ的毒性及其致毒的分子机制。

针对以上存在的问题，关于TQ的后续研究应主要集中于以下几个方面：①注重TQ标准品的合成，建立标准物质，便于检测方法的建立。注重检测方法的实用与便利，积极探索建立TQ的检测方法，以便科学定量食品中TQ含量。②系统研究TQ在特定食品加工过程中的含量变化，为科学控制TQ在食品加工及烹调过程中的生成及迁移奠定一定的理论基础。③TQ的毒性需要进一步研究，如对于正常细胞的致毒性需要研究论证,作为潜在的食品健康危害因子，需进一步通过体外、体内实验佐证其毒性及其致毒分子机制。