精炼工艺对浸出油茶籽油化学成分及抑菌活性的影响

段 彦, 黄 丹, 周炎辉, 杨富茗, 周婷婷, 李顺祥,3, 李 娟,3

(1.湖南中医药大学 药学院, 长沙 410208； 2.湖南奇异生物科技有限公司, 长沙 410208；3.湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心, 长沙 410208)

油茶籽油是山茶科山茶属植物油茶(CamelliaoleiferaAbel.)成熟种子经提取所得。研究表明，油茶籽油中富含不饱和脂肪酸，还含有茶皂苷、茶多酚、维生素E、角鲨烯和类胡萝卜素等多种生物活性物质[1]，长期食用可降血脂、降血压、延缓动脉粥样硬化、降低心血管疾病的发生率[2]。油茶籽油除食用外，还可外涂于烫烧伤、湿疹等患处，有效治疗皮炎、压疮、烧伤、新生儿红臀、尿布皮炎和小儿尿布疹等[3-4]。

油茶籽油因具有与皮肤良好的亲和性，对脂溶性物质良好的促渗性[5]，有效抑制皮脂分泌、改善皮肤代谢状况等优点，常被作为化妆品和医药产品的基质辅料，但临床应用发现，未经精炼的油茶籽油易发生氧化酸败变质，从而引起皮肤瘙痒，甚至诱发皮肤炎症[6]。因此，工业上油茶籽油作为化妆品等外用产品的基质时，需经过脱酸、脱色和脱臭等精炼工艺处理。但有研究[7-8]报道，油茶籽油经不同精炼工艺精制后，虽降低了其不良反应，但其抗菌消炎活性显著降低，甚至消失。为此，本文以不同精炼阶段的油茶籽油样品为研究对象，运用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)监测油茶籽油化学成分的变化规律，并结合体外抑菌实验，分析不同精炼工艺对油茶籽油抗菌活性物质的影响规律，以进一步科学指导油茶籽油的精炼工艺，为医药产品、防护化妆品领域开发质优稳定的油茶籽油基料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

油茶籽油样品〔浸出油茶籽原油(JCCY)，批号为20201028；脱酸油茶籽油(TUCY)，批号为20201028-1；脱色油茶籽油(TECY)，批号为20201028-2；脱臭油茶籽油(TCCY)，批号为20201028-3〕，由湖南奇异生物科技有限公司提供。阿莫西林胶囊(珠海联邦制药股份有限公司，批号为90305002)，氟哌酸胶囊(河南天方药业股份有限公司，批号为190410132)，氟康唑胶囊(广东逸舒制药股份有限公司，批号为202000204)，营养肉汤琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号为20191126)，改良马丁琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司，批号为1073301)，氯化三苯基四氮唑试剂(国药集团化学试剂有限公司，批号为20191203)，分析级乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号为20210514)，甲酸(德国CNW公司，批号为N030K060)，色谱级甲醇(德国MERCK公司，批号为1746030430)，色谱级乙腈(德国MERCK公司, 批号为1746030430)，超纯水(实验室超纯水机自制)。

1.1.2 菌株

大肠杆菌(Escherichiacoli，ATCC44102)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC26003)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC90271)、白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC10231)，均购自南京便诊生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

SPX-70BⅢ型生化培养箱；SW-CJ-1FD型净化工作台；BKQ-B50Ⅱ型压力蒸汽灭菌器；BSA124S-CW型电子天平；HH-600型水浴锅；MassHunter质谱工作站、Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱、Acquity超高效液相色谱仪、双源电喷雾离子源，美国Waters公司；Mini-Q Intergral纯水系统，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同精炼阶段油茶籽油样品的前处理

分别称取JCCY、TUCY、TECY和TCCY各100 g，置于500 mL分液漏斗中，加入甲醇萃取5次，每次100 mL，合并萃取液，50 ℃减压浓缩至无甲醇滴出，冷却，称量质量，得4种不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取液(JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M)和油茶籽油甲醇萃取余相(JCCY-O、TUCY-O、TECY-O和TCCY-O)，4 ℃保存。

1.2.2 不同油茶籽油样品供试品溶液的制备

取JCCY、TUCY、TECY、TCCY、JCCY-O、TUCY-O、TECY-O和TCCY-O各5 g，置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，过0.22 μm微孔滤膜，即得500 mg/mL的母液，密封，4 ℃保存。另取JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M各1.0 g，置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，过0.22 μm微孔滤膜，即得100 mg/mL的母液，密封，4 ℃保存。

1.2.3 阳性对照溶液的配制

取阿莫西林(Amoxicillin，AMC)胶囊、氟哌酸(Norfloxacin，NFX)胶囊、氟康唑(Fluconazole，FLU)胶囊各1粒，用无菌生理盐水溶解，并稀释成5 μg/mL的溶液，过0.22 μm微孔滤膜，即得阳性对照溶液，临配临用。

1.2.4 抑菌活性考察

1.2.4.1 菌株的复苏、培养及菌混悬液制备

将不同菌株分别接种于相应的琼脂平板上，置37 ℃恒温箱中培养，细菌培养18～24 h，真菌培养48 h，挑取单个纯菌落接种于无菌营养肉汤培养基中，用无菌营养肉汤稀释，通过麦氏比浊管调节菌液浓度至1×105CFU/mL。

1.2.4.2 不同油茶籽油样品抑菌圈的测定

采用打孔法测定油茶籽油供试品的抑菌圈[9]。取24 cm×12 cm无菌琼脂平板，接种1.0 mL浓度为1×105CFU/mL的菌混悬液，用涂布棒涂布均匀后，用孔径为6 mm的打孔器打孔，每孔间隔4 cm，用接种针挑出琼脂块，每孔加入相应油茶籽油供试品溶液(JCCY、TUCY、TECY、TCCY、JCCY-O、TUCY-O、TECY-O和TCCY-O，工作质量浓度均为100 mg/mL;JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M，工作质量浓度均为50 mg/mL)各200 μL作为给药组，无水乙醇为空白对照组，以阿莫西林作为S.aureus的阳性对照药物，氟哌酸作为E.coil和P.aeruginosa的阳性对照药物，氟康唑作为C.albicans的阳性对照药物，置37 ℃恒温箱中培养，细菌培养18～24 h，真菌培养48 h，实验重复3次，游标卡尺检测抑菌圈直径，取平均值。

1.2.5 不同精炼阶段油茶籽油甲醇萃取液的化学成分分析

取JCCY-M、TUCY-M、TECY-M和TCCY-M各5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，15 000 r/min离心10 min后，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，上机待测。

液相色谱条件：ACQUITY UPLC-BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱程序为0～2 min70%～50% A，2～8 min 50%～30% A，8～16 min30%～20% A，16～28 min 20%～10% A，28～30 min10% A;流速0.3 mL/min;柱温30 ℃;进样量1 μL。

质谱条件:应用电喷雾正、负离子模式进行检测，扫描方式为MRE扫描，使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix(G1969-8500)对准确质量数进行矫正。一级全扫质量扫描范围(m/z)100～1 200，分辨率 30 000，除溶剂气体为氮气，干燥气流速6.8 L/min，毛细管电压4.0 kV，Fragment电压110 V，鞘气温度350 ℃。二级质谱使用依赖性扫描，在一级扫描基础上选择前三强进行诱导碰撞解离(CID)获取二级质谱数据。

1.2.6 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 不同油茶籽油样品抑菌活性比较

以抑菌圈大小衡量油茶籽油样品的抑菌活性，不同油茶籽油样品的抑菌圈直径见表1。由表1可见：不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取余相和乙醇空白对照无抑菌作用，说明溶剂无干扰；4个不同精炼阶段的油茶籽油样品及其甲醇萃取液对E.coil、S.aureus、P.aeruginosa和C.albicans有一定的抑制作用；不同精炼阶段的油茶籽油的抑菌活性依次为JCCY>TUCY>TECY>TCCY，不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取液的抑菌活性依次为JCCY-M>TUCY-M>TECY-M>TCCY-M，甲醇萃取液的抑菌趋势与各精炼阶段油茶籽油的抑菌趋势相同,说明浸出油茶籽原油经脱酸、脱色和脱臭等精炼工艺后，其抑菌活性依次降低，在不同的精炼过程中均去除了一定量的抑菌活性物质。不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取液的抑菌活性显著高于相对应的精制油茶籽油，说明以甲醇为溶剂，采用萃取的方法可以有效地将油茶籽油中的抑菌成分富集在甲醇萃取液中。

表1 不同油茶籽油样品的抑菌圈直径(n=3) mm

2.2 不同精炼阶段油茶籽油甲醇萃取液成分变化规律

2.2.1 UPLC-Q-TOF-MS成分分析

应用正、负离子模式对油茶籽油甲醇萃取液供试品溶液进行检测，不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取液在正离子模式下的总离子流图(正离子模式下检测出的化合物数量大于且包括负离子模式下的所有化合物)见图1。由图1可见，不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取液供试品溶液的总离子流图存在较大差异，说明浸出油茶籽原油在经过脱酸、脱色和脱臭工艺后，其化学成分发生了显著的变化。在JCCY-M中共鉴定出47个化合物，TUCY-M、TECY-M和TCCY-M中化学成分依次减少，JCCY-M的化学成分组成多为脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸和花生酸等，以及脂肪酸酯和脂肪酸酰胺等衍生物，还含有根皮素、葛根素、绿原酸、儿茶素衍生物、α-生育酚和3-对香豆酰基奎宁酸等酚类化合物，除此之外，还含有芳樟醇-3-鼠李糖基-(1→6)-葡糖糖苷、2,8-二氢喹啉-β-D-葡糖糖苷、茶碱、叶黄素和胡萝卜素等成分。

图1 油茶籽油甲醇萃取液在正离子模式下的总离子流图

2.2.2 差异性化学成分的筛选与比较

借助MassLynx 4.1工作站，将UPLC-Q-TOF-MS数据在正离子模式下选择合适的加合离子，把4种不同精炼阶段油茶籽油的甲醇萃取液分为4组，进行峰对齐、峰提取、归一化和多元统计分析，筛选出符合要求的化合物。将各化合物的数据信息导入SIMCA 16.1软件，进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，得到4种油茶籽油甲醇萃取液的OPLS-DA图，见图2。由图2可见，JCCY-M与其他3种油茶籽油甲醇萃取液(TUCY-M、TECY-M和TCCY-M)分为2类，同时TUCY-M、TECY-M和TCCY-M之间也有一定的差距，说明油茶籽油精炼前后化学成分存在明显差异。4种油茶籽油甲醇萃取液的S-plot图见图3。如图3所示，在S-plot图中一个点代表一个成分，S曲线两端的成分即为差异性成分，越靠近两端表示差异越明显，VIP值大于1.0即认为具有显著性差异，以此筛选4种油茶籽油甲醇萃取液的差异性成分，结合4种油茶籽油甲醇萃取液UPLC-Q-TOF-MS分析结果，共筛选出20个差异性成分，见表2。由表2可知，油茶籽油精炼后甲醇萃取液中具有显著差异的化合物包括油酸、亚油酸及其衍生物，儿茶素衍生物、α-生育酚、葛根素和绿原酸等多酚类化合物，叶黄素和胡萝卜素等色素成分。

注：1.JCCY-M; 2.TUCY-M; 3.TECY-M; 4.TCCY-M

图3 4种油茶籽油甲醇萃取液的S-plot图

由表2还可知：在经过脱酸工艺后，20个变化显著的成分中13个成分未检出，包括葛根素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、2,8-二氢喹啉-β-D-葡糖糖苷、二十一烷酸、十八胺、十五酸乙酯、茶碱、2,4,12-十八碳三烯酸异丁酰胺、绿原酸、油酸正丁酯和α-生育酚，7个成分显著减少；在脱酸基础上，经过脱色和脱臭工艺，7个减少的成分均未检出，分别是十五酰甘氨酸、亚油酸、叶黄素、油酸、9-羟基亚油酸、棕榈油酰乙醇胺和3,6-环氧基-5,5′,6,6′-四氢-3′,5,5′,6′-四羟基-b,b-胡萝卜素。

表2 油茶籽油精炼后甲醇萃取液中具有显著差异的化合物

2.3 分析与讨论

油茶籽油主要成分是不饱和脂肪酸，其他活性成分含量均较低，通过常规分析检测手段如HPLC、GC-MS，许多成分难以检出，这对油茶籽油化学成分的表征有较大的限制，故本实验采用萃取的方法对油茶籽油中低含量成分进行富集，同时采用高分辨率、高灵敏度的UPLC-Q-TOF-MS对甲醇萃取液进行分析鉴定，以求全面系统地分析油茶籽油中的化学成分。进行抑菌圈实验时，要求供试品溶液在培养基中能够均匀扩散，故实验选择乙醇为溶剂，设置溶剂空白，排除乙醇对实验结果的干扰，同时在前期实验中进行了最低抑菌浓度(MIC)的测定，确定抑菌圈实验中不同油茶籽油样品的最适浓度。

本实验通过打孔法对不同精炼阶段油茶籽油及其甲醇萃取液，以及甲醇萃取余相的抑菌活性进行考察，综合比较不同油茶籽油样品的抑菌圈直径，确定其抑菌活性物质主要存在于甲醇萃取液，后续采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析4种油茶籽油甲醇萃取液的化学成分，通过SIMCA 16.1软件筛选显著变化的成分，发现油茶籽油在经过不同的精炼工艺后，其中的部分化学成分显著减少。经过水化脱胶和碱炼脱酸后，油酸、亚油酸及其他游离脂肪酸含量显著减少，可以有效降低油茶籽油的酸值，提高油茶籽油品质和保存时间，同时没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯和绿原酸等酚类化合物未检出，推测此类成分含有多元酚、不饱和酯键，结构不稳定，在水化高温和碱性条件下易分解或生成酚盐，其分解产物以及酚盐为水溶性化合物，易溶于水相中而被除去，可能是导致上述成分在脱胶脱酸后未检出的主要原因；油脂中的色素主要包括有机色素、有机降解物和色原体等3类，本研究中油茶籽油是以正己烷冷浸制得，故其中的色素类成分主要是胡萝卜素(使油脂呈红色)和叶黄素(使油脂呈黄色)等脂溶性植物色素，在经过活性炭与硅藻土吸附脱色后二者均未检出，故油脂呈透明状；在真空脱臭后油茶籽油中引起臭味的组分如低级醛、酮、游离脂肪酸、不饱和碳氢化合物等均被除去，在油茶籽油中未检出，但α-生育酚等低沸点物质也在此过程中损失。

化学成分的变化影响油茶籽油样品的抑菌活性，在油茶籽油精炼后除去的成分中，许多成分具有较好的抑菌作用，如没食子儿茶素、表没食子儿茶素和儿茶素没食子酸酯等儿茶素衍生物具有较好的抑菌效果，能有效抑制细菌和真菌[10-12]，绿原酸作为广谱抑菌活性物质，对多种病原微生物有抑制作用[13]，葛根素、胡萝卜素和α-生育酚也被证明具有一定的抑菌活性[14-16]，此外，有研究显示奎宁酸的衍生物同样具有较好的抑菌作用[17-18]，故油茶籽油中3-对香豆酰基奎宁酸也可能是潜在的抑菌物质。随着油茶籽油精炼程度的加深，一些化学成分不断减少或者消失，其抑菌活性也不断降低，但精炼后的油茶籽油仍具有一定抑菌作用，这可能与3-对香豆酰基奎宁酸的存在相关。通过比较分析油茶籽油精炼前后的化学成分变化及对抑菌活性的影响，初步推测油茶籽油中的抑菌活性物质是儿茶素衍生物、绿原酸、葛根素、胡萝卜素、α-生育酚和3-对香豆酰基奎宁酸等成分。

3 结 论

本实验通过测定油茶籽油在精炼过程中化学成分与抑菌活性的变化，将油茶籽油的抑菌活性与其化学成分关联起来，推测出油茶籽油中的主要抑菌活性物质为儿茶素衍生物、绿原酸、葛根素、胡萝卜素、α-生育酚和3-对香豆酰基奎宁酸等成分。研究结果可为油茶籽油精炼工艺的优化提供部分参考依据，能提高油茶籽油的附加值，对油茶籽油产业的发展有一定的推动作用。本实验油茶籽油主要作为外用油脂原料和基质，适用于化妆品、外用膏剂等产品，在满足其使用要求的同时，欲保留其中的抑菌活性成分，根据上述推测抑菌成分的性质，可对精炼工艺进行改进。一是采用更加温和的精炼技术，如采用改性膨润土无水精炼技术、膜分离技术以及分子蒸馏技术等，这些新型技术反应条件温和，对油茶籽油中的活性成分影响较小；二是结合活性成分的理化性质，采用合适的手段如萃取、结晶和蒸馏等，将油茶籽油中的活性成分优先分离保存，精炼完成后再重新添加。