偏甘油酯脂肪酶Lipase G50的固定化及其催化高酸值米糠油乙酯化脱酸的研究

陈东升，刘 建，刘 宁，李道明

(1.中粮工科(西安)国际工程有限公司，西安 710082； 2.陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

偏甘油酯脂肪酶，与传统甘油三酯脂肪酶相比，其仅能作用于甘油单酯和甘油二酯，而不能作用于甘油三酯。偏甘油酯脂肪酶独特的甘油酯底物特异性使其近十年来在油脂改性领域引起了广泛关注。常用的偏甘油酯脂肪酶主要有PCL(来源于Penicilliumcamembertii)、SMG1(来源于Malasseziaglobose)、MgMDL2(来源于Malasseziaglobose)、AOL(来源于Aspergillusoryzae)和PcMDL(来源于Penicilliumcyclopium)[1]。与其他4种偏甘油酯脂肪酶相比，PCL的最适反应温度最高(40℃)，应用范围最广[1-2]，而且其是5种常用偏甘油酯脂肪酶中唯一一种商品化脂肪酶(商品化名Lipase G50)。近年来Lipase G50被广泛应用于催化制备或去除偏甘油酯(甘油单酯、甘油二酯或甘油单酯与甘油二酯混合物)[3-11]和催化植物油环氧化[12]等。如：Freitas等[7]将固定化Lipase G50(固定于环氧SiO2-PVA上)应用于催化甘油与脂肪酸酯化制备甘油单酯，发现Lipase G50对肉豆蔻酸和棕榈酸具有较高的特异性，反应产物主要为1-单甘酯，且最终的反应混合物达到了世界卫生组织确定的用作食品乳化剂的要求；徐扬等[9]将Lipase G50应用于催化甘油与脂肪酸酯化制备甘油二酯，在优化的反应条件下，甘油二酯含量达44.7%；郑平玉[10]采用Lipase G50催化甘油与油茶籽油脂肪酸酯化制备甘油二酯，在优化的反应条件下，产物中甘油二酯含量为49.9%；徐扬等[11]将固定化Lipase G50应用于催化甘油与脂肪酸酯化制备甘油二酯，固定化Lipase G50连续使用5个批次后，仍能保持其最初活力的86.1%。Padhi等[8]采用Lipase G50催化转酯化去除脂肪酸甲酯中的甘油单酯，可将饱和脂肪酸甘油单酯含量由2%降低至0.14%。除了制备和去除偏甘油酯外，Zhou等[12]研究在低共溶溶剂中采用Lipase G50催化环氧化制备环氧植物油，结果发现，在低共溶溶剂中，Lipase G50使环氧植物油的生产变得高效。而目前关于Lipase G50在其他油脂改性领域的应用报道较少。

高酸值米糠油通常是指酸值(KOH)大于20 mg/g的米糠油。目前常用的脱酸方法主要有化学碱炼脱酸和物理蒸馏脱酸，前者存在中性油和脂类伴随物损失大及产生工业废水等问题[13]，后者存在能耗大及产生脂类风险因子(缩水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等)的风险[14-15]。相比于化学碱炼脱酸和物理蒸馏脱酸，采用脂肪酶催化脱除米糠油中的游离脂肪酸具有反应条件温和、中性油和脂类伴随物保留率高及安全环保等优点，近年来成为油脂脱酸领域的研究热点。目前，应用于油脂脱酸的甘油三酯脂肪酶主要为Novozym 435、Lipozyme 435、Lipozyme RM IM及Lipozyme TL IM等[16-20]，应用于油脂脱酸的偏甘油酯脂肪酶主要为SMG1-F278N[21-22],但关于Lipase G50应用于油脂脱酸的研究还未见报道。

本文研究了Lipase G50在高酸值米糠油脱酸中的应用潜力。考虑到游离酶存在稳定性差、回收难等问题，先将Lipase G50进行固定化，对固定化的载体和载酶量进行了优化；随后，将固定化Lipase G50应用于高酸值米糠油脱酸，对反应条件进行了优化，并评估了固定化Lipase G50的操作稳定性；最后，对脱酸米糠油进行了纯化，并对纯化产物的甘油酯组成进行了测定，以期为固定化Lipase G50在高酸值米糠油脱酸中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Lipase G50(Penicilliumcamembertii游离酶，酶活力50 000 U/g)，日本天野酶制剂集团；高酸值米糠油，已脱胶处理，酸值(KOH)为62.14 mg/g，过氧化值为5.58 mmol/kg，实验室制备；三油酸甘油酯(纯度>99%)、二油酸甘油酯(纯度>99%)、单油酸甘油酯(纯度>99%)，上海Sigma-Aldrich有限公司；脂肪酸乙酯混标21组分(C14～C24)，美国Nu-Chek公司；牛血清蛋白，上海吉至生化科技有限公司；无水乙醇，分析纯；正己烷、异丙醇、甲酸，色谱纯；ECR1030树脂、ECR8285树脂，漂莱特(中国)有限公司；DA-201树脂、AB-8树脂、D380树脂，南开大学化工厂。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；Agilent 7890A气相色谱仪(配备氢离子化火焰检测器)，安捷伦科技有限公司；MD-S80短程分子蒸馏，广州汉维科技有限公司；H1650-W小型离心机；Waters 2695高效液相色谱仪(配备Waters 2414示差检测器)，美国Waters公司；IR-35近红外水分测定仪；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂预处理

树脂ECR1030和ECR8285无需处理(厂家已处理好)。DA-201、AB-8、D380 3种树脂采用95%乙醇浸泡赶出树脂中的气泡,再分别采用5% HCl和2% NaOH浸泡去除树脂孔隙中残留的分子单体，每次处理完成后采用去离子水冲洗树脂，直至冲洗流出液pH为中性为止；最后采用20 mmol/L pH 5.6的磷酸盐缓冲液浸泡树脂，定期更换缓冲液，直至缓冲液pH不再变化为止。预处理完成后的树脂沥干后放于4℃冰箱储存备用。

1.2.2 Lipase G50的固定化

准确称取2 g预处理后的湿树脂于500 mL具塞锥形瓶中，加入58.84 mL Lipase G50溶液(Lipase G50酶粉溶于20 mmol/L pH 5.6的磷酸盐缓冲液，蛋白质质量浓度为1.02 mg/mL),使酶与湿树脂的比例(载酶量)为30 mg/g，随后加入58.84 mL20 mmol/L pH 5.6的磷酸盐缓冲液(ECR8285树脂实验时加入1.5 mol/L pH 5.6的磷酸盐缓冲液)，随后将具塞锥形瓶置于30℃恒温气浴摇床中以120 r/min转速振荡8 h。振荡结束后，过滤，分别收集固定化酶和滤液，收集得到的滤液测定蛋白质质量浓度，收集得到的固定化酶用相同的缓冲液冲洗至流出液测不出蛋白质为止，于真空干燥箱40℃下干燥8 h，得到固定化Lipase G50。

1.2.3 蛋白吸附量的测定

采用Bradford法测定固定化前后酶溶液的蛋白质质量浓度。每组数据平行测定3次。

固定化酶蛋白吸附量(A)按式(1)进行计算。

(1)

式中：m1为固定化前Lipase G50酶溶液中的蛋白质质量，mg；m2为固定化后收集得到的滤液中的蛋白质质量，mg；m为干燥后固定化酶的质量，g。

1.2.4 固定化Lipase G50酯化活力的测定

固定化Lipase G50酯化活力的测定参照诺维信标准分析方法进行。于25 mL具塞三角瓶中加入0.46 g正丙醇、1.54 g月桂酸，随后加入6 mL正庚烷，待月桂酸溶解后加入底物总质量3%的蒸馏水，随后在40℃恒温振荡器中预热5 min，再加入50 mg固定化Lipase G50，酯化反应10 min后，立即取样20 μL于980 μL正庚烷中，待气相色谱分析。每组实验重复3次。

GC条件：OV351色谱柱(60 m×0.32 mm×0.10 μm)；分流比40∶1；进样量1 μL；柱前压0.137 9 MPa；进样口温度250℃；FID检测器温度280℃；空气流量450 mL/min，氢气流量40 mL/min，载气(氮气)流量25 mL/min；升温程序为140℃保持2 min，随后以5℃/min升至210℃，保持15 min。采用面积归一化法进行定量。

固定化Lipase G50酯化活力(E1)按式(2)进行计算。

(2)

E=n1/(n1+n2)

(3)

式中：I为月桂酸初始物质的量，mol；E为月桂酸酯化率；m为固定化酶质量，g；t为反应时间，min;n1、n2分别为酯化产物中丙基月桂酸酯和月桂酸的量，mol。

固定化脂肪酶比活力(E2)按式(4)进行计算。

E2=E1/C

(4)

式中：C为固定化酶中的蛋白质含量(固定化Lipase G50的蛋白吸附量)，mg/g。

1.2.5 固定化Lipase G50水分含量的测定

采用IR-35近红外水分测定仪对固定化Lipase G50的水分含量进行测定。测定前，先将仪器预热15 min，随后称取250 mg固定化Lipase G50置于托盘上，盖上盖子于110℃下测定至读数稳定，记录固定化Lipase G50水分含量。

1.2.6 固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脱酸

于2.0 L反应瓶中加入100 g高酸值米糠油，随后加入400 mL正己烷和1/3所需无水乙醇，在250 r/min的转速下混合均匀后，加入一定量固定化Lipase G50，开始计时，保持转速250 r/min，在一定温度下进行反应。剩余2/3无水乙醇分别在反应3 h和5 h时等量加入，反应6 h后取样100 μL，置于4℃冰箱，待HPLC分析其组成。

1.2.7 固定化Lipase G50的操作稳定性评估

在优化的反应条件下对固定化Lipase G50的操作稳定性进行评估，每个反应批次结束后，过滤回收固定化Lipase G50，采用10 mL正己烷冲洗3次后，用于下一批次的反应。每次反应结束后通过测定脱酸米糠油的酸值来评价固定化Lipase G50的操作稳定性。

1.2.8 HPLC分析脱酸米糠油的甘油酯组成

将样品溶于1 mL流动相中，加入0.5 g无水硫酸钠除水，于10 000 r/min离心2 min，取800 μL上清液，进行HPLC分析。

HPLC条件：示差折光检测器(RID)；EXL-127-2546U色谱柱(250 mm×4.6 mm)；流动相为正己烷-异丙醇-甲酸(体积比18∶1∶0.003)，流速1 mL/min；柱温箱温度30℃；进样量10 μL。

各组分采用标准品定性，外标法定量。

1.2.9 放大实验与脱酸产物分离纯化

在优化的反应条件下进行放大实验。以2 kg高酸值米糠油为原料，脱酸反应结束后过滤回收固定化酶，旋转蒸发回收正己烷。

本研究采用乙醇作酰基受体，将各米糠油中的游离脂肪酸转化为脂肪酸乙酯，由于脂肪酸乙酯具有较低沸点，可通过分子蒸馏去除。因此，采用短程分子蒸馏对产物进行分离纯化。分子蒸馏条件：进料温度60℃，进料流量1.5 g/min，压力1.38 Pa，蒸发面温度120℃，刮膜速度280 r/min，冷凝水温度35℃。

1.2.10 米糠油酸值、过氧化值的测定

米糠油酸值的测定参照GB 5009.229—2016，过氧化值的测定参照GB 5009.227—2016。

2 结果与讨论

2.1 Lipase G50的固定化

2.1.1 固定化载体的筛选

固定化过程中酶与载体的结合方式、结合牢固程度、酶的结合导向及载酶量等都直接影响固定化酶的活力和稳定性[23]。按1.2.2方法采用5种树脂对Lipase G50进行固定化，测定固定化酶的蛋白吸附量、酯化活力、比活力，考察不同树脂对Lipase G50固定化的影响，结果如表1所示。由表1可知，与其他4种树脂相比，ECR8285树脂对Lipase G50进行固定化得到的固定化酶具有最高的蛋白吸附量、酯化活力和比活力，表明ECR8285更适宜于Lipase G50的固定化。采用其他4种树脂对Lipase G50进行固定化属于物理吸附法，而采用ECR8285对Lipase G50固定化属于化学结合法，相比于其他几种载体，ECR8285对Lipase G50进行固定化的过程中，Lipase G50与ECR8285的结合位点及Lipase G50固定化后的位置导向更有利于固定化Lipase G50活力的展现。因此，本研究选择ECR8285树脂对Lipase G50进行固定化。

表1 不同树脂对Lipase G50固定化的影响

2.1.2 载酶量对Lipase G50固定化的影响

脂肪酶固定化过程中载酶量不仅影响固定化酶的活力、比活力，而且直接影响反应的经济性[24]。按1.2.2方法，采用ECR8285树脂对Lipase G50进行固定化，改变Lipase G50溶液的蛋白质质量浓度，得到不同载酶量的固定化酶，测定固定化酶的蛋白吸附量、酯化活力和比活力，考察载酶量对Lipase G50固定化的影响，结果如图1所示。

图1 载酶量对Lipase G50固定化的影响

由图1可以看出：蛋白吸附量随着载酶量的增加而增加，当载酶量达到40 mg/g时，蛋白吸附量达到平衡，表明ECR8285对Lipase G50的结合达到饱和；固定化Lipase G50的酯化活力随着载酶量的增加而增加，当载酶量达到35 mg/g时，增加幅度放缓，这可能是由于随着ECR8285上Lipase G50结合量的增加，酶分子彼此之间相互影响，从而影响了固定化酶酯化活力的增加；固定化Lipase G50的比活力随着载酶量的增加而降低，可能是由于随着蛋白吸附量的增加，酶分子之间相互影响，增加了酶分子与底物分子结合的空间位阻，从而引起固定化酶比活力的下降。综合考虑，选择载酶量为40 mg/g制备固定化Lipase G50。

在上述优化条件下，对Lipase G50的固定化实验放大50倍，得到的固定化酶蛋白吸附量为33.14 mg/g，酯化活力为518.66 U/g，比活力为15.65 U/mg，水分含量为1.98%。

2.2 固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脱酸的单因素实验

2.2.1 无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比对脱酸的影响

在反应温度35℃、酶加量30 U/g(基于高酸值米糠油的质量，下同)、反应时间6 h条件下，研究无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比对固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脱酸的影响，结果如图2所示。

图2 无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比对脱酸的影响

由图2可以看出，当无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比为1∶1时，脱酸米糠油的酸值(KOH)最高，达12.74 mg/g。这主要是由于高酸值米糠油中除了含大量的游离脂肪酸(30.68%)外，还含有一定量的偏甘油酯(0.25%甘油单酯和9.22%甘油二酯)，当采用固定化Lipase G50作催化剂、无水乙醇作酰基受体催化高酸值米糠油脱酸时，无水乙醇除了与游离脂肪酸发生酯化反应外还会与偏甘油酯发生醇解反应，所以当无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比为1∶1进行脱酸时，无水乙醇的添加量远不能满足脱酸反应的需要，所以脱酸后米糠油的酸值仍然较高。当无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比为1.5∶1时，脱酸米糠油的酸值(KOH)降至2.87 mg/g；进一步增加无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比至2∶1时，脱酸米糠油的酸值(KOH)降至0.66 mg/g，然而当无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比增加至2.5∶1时，脱酸后米糠油的酸值(KOH)为1.21 mg/g，与2∶1时相比略有升高，这可能是由于过高的无水乙醇添加量，影响了固定化Lipase G50的酯化活力，从而降低了固定化Lipase G50的脱酸效果。因此，选择无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比为2∶1。

2.2.2 酶加量对脱酸的影响

在无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比2∶1、反应温度35℃、反应时间6 h条件下，研究酶加量对固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脱酸的影响，结果如图3所示。

图3 酶加量对脱酸的影响

由图3可知，随着酶加量的增加脱酸效果逐渐变好。当酶加量为40 U/g时，脱酸米糠油的酸值(KOH)降至0.31 mg/g，尽管酶加量为50 U/g时，脱酸米糠油的酸值(KOH)降至0.27 mg/g，但与酶加量40 U/g相比没有显著差异(p>0.05)，这可能是由于当酶加量为40 U/g时，酶与底物已基本达到饱和，进一步增加酶加量并不会显著增强脱酸效果。出于经济性的考虑，选择酶加量为40 U/g。

2.2.3 反应温度对脱酸的影响

在无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比2∶1、酶加量40 U/g、反应时间6 h条件下，研究反应温度对固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脱酸的影响，结果如图4所示。

图4 反应温度对脱酸的影响

由图4可知，随反应温度升高，脱酸米糠油的酸值先降低后升高。固定化Lipase G50在反应温度40℃时具有最优的脱酸效果，脱酸米糠油的酸值(KOH)降至0.12 mg/g。反应温度超过40℃后，脱酸米糠油的酸值增加，这可能是由于一方面高温影响了固定化Lipase G50的反应活力(因为游离Lipase G50的最适反应温度为37℃)，另一方面，高温加速了反应底物乙醇的挥发，从而使脱酸效果降低。因此，选择反应温度为40℃。

综上，确定固定化Lipase G50催化高酸值米糠油脱酸的最佳反应条件为：无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比2∶1，酶加量40 U/g，反应温度40℃，反应时间6 h。

2.3 固定化Lipase G50的操作稳定性

在上述优化的反应条件下，以每个批次结束后脱酸米糠油的酸值为指标，研究固定化Lipase G50的操作稳定性，结果如图5所示。

图5 固定化Lipase G50的操作稳定性

由图5可知，固定化Lipase G50连续使用10个批次后，脱酸效果与第一个批次相比没有显著差异(p>0.05)。进一步对10个批次结束后回收得到的固定化Lipase G50的酯化活力进行分析发现，固定化Lipase G50的酯化活力为509.22 U/g，与初始制备得到的固定化Lipase G50的酯化活力(518.66 U/g)相比没有显著差异，表明固定化Lipase G50在催化高酸值米糠油脱酸过程中具有优异的操作稳定性。

2.4 放大实验与产物分离纯化

2 kg高酸值米糠油经酶法脱酸放大实验、分子蒸馏，得到1.16 kg脱酸米糠油和0.83 kg脂肪酸乙酯，米糠油精炼得率为58%。高酸值米糠油、脱酸米糠油及分子蒸馏纯化产物的甘油酯组成如表2所示。

表2 高酸值米糠油、脱酸米糠油及分子蒸馏纯化产物的甘油酯组成 %

由表2可知，脱酸米糠油的游离脂肪酸含量降至0.06%(酸值(KOH)为0.12 mg/g)，分子蒸馏纯化产物中游离脂肪酸含量为0.10%，甘油三酯含量为97.58%。高酸值米糠油经脱酸、分子蒸馏纯化后，酸值(KOH)由62.14 mg/g降至0.19 mg/g，过氧化值由5.58 mmol/kg降至2.16 mmol/kg，酸值和过氧化值均达到了GB/T 19112—2003一级米糠油标准。结果表明固定化Lipase G50是催化高酸值米糠油脱酸的有效催化剂，在油脂脱酸领域具有较好的应用前景。

3 结 论

本文探究了固定化Lipase G50在高酸值米糠油脱酸中的应用潜力。首先筛选了适宜的固定化载体，发现环氧树脂ECR8285对Lipase G50的固定化效果最好，在载酶量为40 mg/g时，制备的固定化Lipase G50的酯化活力达到518.66 U/g。将制备的固定化Lipase G50应用于高酸值米糠油脱酸，最佳脱酸工艺条件为：无水乙醇与游离脂肪酸物质的量比 2∶1，酶加量40 U/g，反应温度40℃，反应时间6 h。在最佳脱酸条件下，高酸值米糠的酸值(KOH)由62.14 mg/g降至0.12 mg/g，且在脱酸过程中固定化Lipase G50展现出了优异的操作稳定性，连续使用10个批次后，固定化Lipase G50的酯化活力为509.22 U/g，与初始固定化Lipase G50相比，酯化活力没有显著降低。分子蒸馏纯化产物的酸值(KOH)为0.19 mg/g，过氧化值为2.16 mmol/kg，达到了一级米糠油标准。因此，固定化Lipase G50在油脂脱酸领域具有较好的应用前景。