柴胡皂苷对氨气暴露下雏鸡盲肠微生物群落及行为学的影响

徐 丹，杜 红，易 鑫，张国华，白世平，舒 刚*

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川农业大学动物医学院，成都 611130；3.四川农业大学动物营养所，成都 611130）

现今集约化养殖环境下，各种有害环境因素损害着动物机体的健康。氨气是一种具有强烈刺激气味的有毒有害气体[1-2]，作为畜舍中危害最大的有害气体之一，给畜禽带来严重的应激反应，损害动物健康，给畜牧业带来严重的经济损失。家养畜禽中，禽类对氨气最为敏感，因此，高浓度的氨气严重制约了养禽业的发展和利益。

鸡的肠道定植着大量的微生物菌落，它们是维持机体正常消化、代谢和促进免疫机能的基础，对禽类的整体健康和性能起着重要作用[3-4]。越来越多的证据表明，菌群受环境因素的影响很大，远远比宿主因素更重要[5-6]。空气污染物会诱导肠道菌群紊乱，更重要的是，肠道微生物群紊乱参与了空气污染诱导的许多病理生理过程[7-8]。高浓度氨气会导致肉鸡胃肠道微生态平衡遭到破坏，为有害细菌在机体内定植感染提供有利条件，从而影响动物机体健康，间接降低其生产性能，损害畜禽养殖业经济效益[9]。

神经系统也是氨气应激损害机体的另外一个靶点。应激还能影响机体神经系统的功能及神经递质的分泌，进而影响动物机体各个组织脏器及生长发育。氨气作为一种环境应激源，能通过抑制肉鸡脑神经细胞的新陈代谢，导致肉鸡氨中毒，进而抑制肉鸡的采食中枢[10]。应激过程中对神经系统的调节可能是缓解机体应激反应的重要作用靶点。

柴胡皂苷是中药柴胡的主要有效活性成分，具有解热[11]、抗氧化[12]、免疫调节[13]、抗炎[14]以及镇静[15]等药理作用，对动物应激有很好的缓解作用。据此我们推测柴胡皂苷通过调节雏鸡神经系统及肠道菌群以达到抵抗氨气应激的作用。

基于此，本试验旨在研究柴胡皂苷作对氨气暴露下雏鸡盲肠微生物群落的调节作用及对雏鸡神经系统的平衡维持作用，拟阐明有害气体氨气影响雏鸡健康的机理，同时，为柴胡皂苷在缓解养禽业中由氨气应激引发的肠道损伤和维持神经系统的稳态的运用提供理论依据，丰富环境毒理学的研究资料，为氨气中毒的诊断和临床防治及柴胡皂苷在抗应激方面的研发提供理论依据和参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

柴胡皂苷，纯度在99%以上，主要成分为柴胡皂苷a 32.1%，柴胡皂苷c 11.8%，柴胡皂苷d 43.9%，柴胡皂苷e 4.7%，柴胡皂苷f 7.5%（浙江盛世生物技术有限公司，批号201903131）；五羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）Elisa试剂盒（酶免，批号20190709）。

1.2 实验动物饲养及管理

选用480只1日龄初始体重为(38.83±3.45)g的健康AA肉鸡（四川农业大学家禽养殖场提供）开展试验，试验鸡均饲养在环境控制舱中(4 500 mm×3 000 mm× 2 500 mm;长×宽×高，30只/舱)，环境控制舱外接氨气瓶，通过氨气流量计调节控制舱内的氨气供给，同时，饲养过程中使用Lumassense光声场气体监测仪Innova-1412（美国加利福尼亚州圣克拉拉）实时监测舱内的氨气浓度。自由采食与饮水，鸡舍内保持空气湿度在65%±5%，温度在1日龄时保持在35℃左右，2～7日龄保持在32～35℃。1～2日龄每天光照时间为24 h，3～7日龄每天光照时间为16 h，管理方式同常规育雏。

1.3 试验分组及设计

将试验鸡随机分为4组，每组4个重复，每个重复30只，具体分组见表1。试验组鸡只除使用试验药物外，其余各种饲养条件均与空白对照组相同。试验鸡出壳后适应性饲养1 d，试验从雏鸡2日龄开始，至其8日龄结束，共计7 d。

表1 分组及试验处理Table 1 Groups and Treatment Methods of the Experiment

雏鸡日粮根据中国鸡饲养标准结合肉鸡营养需要标准配制[20]，饲料配方及营养水平见表2。

表2 饲粮组成及其营养水平Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets %

1.4 样品采集

试验期间每日观察并记录雏鸡的精神、活动、采食量、饮水、健康状况以及拍照。试验结束后，每组每个重复随机抽取2只雏鸡剖杀后，无菌手术结扎线截取盲肠头端，后在超净工作台中，将盲肠内容物快速挤压到灭菌冻存管中，液氮速冻，放入-80℃冰箱待测。解剖后取脑部，在冰袋上剖取脑部组织海马区，-80℃环境下冷冻保存备用。将脑组织按照1∶9加入无菌生理盐水，制备组织匀浆，收集上清液用于后续NE、DA及5-HT测定。

1.5 生长性能

称量记录每组雏鸡初始重量以及试验终重量，计算平均日增重；记录每日采食量，计算采食量与料肉比。

平均日增重/(g·d-1)=(终末体重-初始体重)/天数

料肉比=消耗饲料总量/增重总量

1.6 盲肠总菌群16S rRNA Illumina扩增子测序

1.6.1 DNA的提取与Illumina扩增子测序

使用十二烷基苯磺酸钠（SDS）法提取32只鸡盲肠菌群基因组DNA，采用NanoDrop-2000检测样本DNA浓度和纯度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性[21]。合格样品用细菌通用引物515F/806R进行16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增(F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;R:5′-GACTACH VGGGTWTCTAAT-3′)，扩增后产物质检、纯化，构建合格文库后，北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成Illumina HiSeq平台测序。

1.6.2 生物信息学分析

测序得到的原始数据，进一步获取干净序列并去除嵌合体数据得到有效数据，基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析。通过软件对OTU代表序列做物种注释，获取对应的各分类水平（门、科、属水平）的组成和丰度分布情况[22]。

1.7 行为学观察

在整个试验周期内，从每个重复中随机选取8只鸡进行标记，采取16个摄像头同时摄录4个处理组（16个重复）雏鸡的行为学表征，每天两次，分别于09:30和14:30开始，每次持续60 min，按照表3项目记录。频次指单位时间内，单只肉鸡各行为发生的平均次数[23]。各种行为频次的异常提示肉鸡的应激状态，肉鸡福利受到损害。

表3 雏鸡主要行为学变量及其描述Table 3 Main behavioral variables of broilers and relevant descriptions

1.8 数据分析

试验数据经分布正态和方差检验后，用SPSS 22.0（spssinc，美国）进行Tukey HSD多重比较检验，数据以平均值±标准误差（Mean±SE）表示。

2 结果与分析

2.1 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡临床表现及生长性能的影响

试验期间，CON和CSP雏鸡精神状态良好，粪便成形，喜趴卧，生长发育良好；与CON相比，NH和NSP雏鸡食欲下降，流泪、结膜潮红，肺部有啰音，异常兴奋，站立走动次数增多，生长发育缓慢，体型明显小于CON和CSP（图1）。生长性能结果如图2所示，与空白组相比，氨气环境下雏鸡的平均日增重、平均日耗料和平均终体重均显著降低(P＜0.05)，分别降低了21.31%、6.95%和14.61%，料肉比增加了17.14%(P＜0.05)；柴胡皂苷能显著提高雏鸡平均日增重和平均终体重(P＜0.05)。

图1 各组雏鸡外观Figure 1 Photos of broliers in each group

图2 各组雏鸡生长性能指标Figure 2 Growth performance in each group

2.2 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡盲肠菌群的影响

2.2.1 盲肠菌群序列样品深度分析

用Illumina HiSeq测序平台，对细菌16s rRNA的V3-V4区进行扩增、测序，序列长度均分布在两个区域，符合本试验目的测序区域。Specaccum累计曲线达到平台期，测序数据量满足试验需要。每个样本平均能获得78 039条高质量有效测序数据，平均读长为403 bp，测序深度和样本数量满足分析要求。

2.2.2 盲肠菌群Alpha(α)多样性分析

α多样性分析采用Observed-OTU指数来预测肠道菌群中的多样性与丰富度，采用Pielouevenness指数来预测肠道菌群群落丰富度和群落均匀度。结果表明（图3），4个组Observed-OTU和Pielou-evenness指数均未表现出显著差异(P＞0.05)。

图3 α多样性分析Figure 3 α diversity analysis

2.2.3 盲肠菌群Beta(β)多样性分析

β多样性分析通过Unweighted UniFrac PCoA、Weighted UniFrac PCoA、Bray-curtis PCoA和Jaccard PCoA进行展示。Unweighted UniFrac PCoA（图4A）和Weighted UniFrac PCoA（图4B）结果一致，分析显示，氨气处理组和正常环境下的处理组样本在三维象限内可以明显区分，而相同环境下的处理组的样本不能很好地区分。Bray-curtis（加权）和Jaccard（非加权）指数（图4C、4D）结果同样表明，正常环境下的处理组的样本可以和高浓度氨气环境下的处理组的样本明显在三维空间中区分开来。不同处理组中雏鸡盲肠菌群β多样性结果如表4所示，结果表明雏鸡的盲肠菌群β多样性受到氨气应激的影响，呈现出与正常环境下健康对照雏鸡不同的群落组成和分布。

表4 各组盲肠菌群β多样性Table 4 The β diversity of cecal flora in each group

图4 β多样性PCoA分析Figure 4 β diversity of PCoA analysis

2.2.4 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡盲肠菌群各分类水平组成的影响

2.2.4.1 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡盲肠菌群门水平的影响

根据OTU划分和分类地位鉴定，不同处理组中雏鸡盲肠菌群在门水平的组成如图5所示，在门水平上的盲肠菌群优势菌门主要由厚壁菌门(Firmicutes)、柔膜菌门(Tenericutes)和变形菌门(Proteobacteria)组成。各组厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度均无明显差异(P＞0.05)。对于柔膜菌门(Tenericutes)的相对丰度，NH显著高于CON(P＜0.05)，同时CSP和NSP显著低于NH(P＜0.05)（表5）。

表5 盲肠菌群门水平优势物种相对丰度Table 5 Relative abundance of dominant species of cecal microflora at phyla level %

2.2.4.2 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡盲肠菌群科水平的影响

由图6所示，在科水平上（至少一个组中平均相对丰度大于0.5%），CON中的优势菌群有9个，约占组内总菌群的56.25%；CSP中的优势菌群有6个，约占组内总菌群的37.5%；NH中的优势菌群有6个，约占组内总菌群的37.5%；NSP中的优势菌群有6个，约占组内总菌群的37.5%。相较于CON，CSP减少了3个优势菌群：厌氧支原体科(Anaeroplasma⁃taceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)及厚壁菌门下一个未知科(D_3__Mollicutes RF39;__;__)；NH也减少3个优势菌群：乳酸细菌科(Lactobacillaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)及厚壁菌门下一个未知科(D_3__Mollicutes RF39;__;__)。相较于NH，CSP增加了1个优势菌群：乳酸细菌科(Lactobacillaceae)，减少1个优势菌群：厌氧支原体科(Anaeroplasmataceae)。NSP和氨气组在科水平上具有相同的优势菌群。

2.2.4.3 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡盲肠菌群属水平的影响

由表6可知，试验雏鸡在属水平上有31个属的优势菌群（至少一个组中平均相对丰度大于0.5%）。在属水平上，CON中共有25个优势菌属，约占组内总优势菌属的80.65%。CSP中共有26个优势菌属，约占组内总优势菌属的83.87%。NH中共有26个优势菌属，约占组内总优势菌属的83.87%，相较于CON，增加4个优势菌属：uncultured Firmicutes bacte⁃rium、Intestinimonas、Ruminiclostridium和Ruminococ⁃caceae UCG-005，减少 3个优势菌属：GCA-900066575、Ruminococcaceae UCG-013和 Lachnospi⁃raceae NK4A136 group。NSP中共有24个优势菌属，约占组内总优势菌属的77.42%，相较于NH，NSP中的优势菌属结构差异很大，增加2个优势菌属：gut metagenome和Ruminococcaceae UCG-013，减少4个优势菌属：Lactobacillus、uncultured Firmicutes bacte⁃rium、Ruminiclostridium和Ruminococcaceae UCG-005。

表6 盲肠菌群属水平优势物种相对丰度Table 6 Relative abundance of dominant species of cecal microflora at genus level

与CON相比，NH中的uncultured Firmicutes bac⁃terium、Flavonifractor、Ruminiclostridium 9、Rumino⁃coccaceae UCG-005和5__uncultured相对丰度显著增加(P＜0.05)，Eisenbergiella、[Ruminococcus]torques group和Ruminococcaceae UCG-013的相对丰度显著减少(P＜0.05)。

2.3 柴胡皂苷对氨气应激雏鸡行为及神经递质的影响

由表7可知，相对于CON，NH组雏肉鸡梳羽、抖身、展翅和走动的频次显著增加(P＜0.05)，趴卧的频次显著降低(P＜0.05)。相对于NH，CSP组雏肉鸡梳羽的频次显著降低(P＜0.05)。各组雏肉鸡饮水、采食和挠头的频次无显著差异(P＞0.05)。

表7 单位时间内各组肉鸡日常行为频次Table 7 Daily behavior frequency of broilers in each group in unit time

各组雏鸡脑部海马区神经递质的含量见表8。结果表明，相较于CON，CSP脑部海马区NE含量显著降低(P＜0.05)，NH脑部海马区NE含量显著增加(P＜0.05)。相较于NH，NSP的NE含量显著降低(P＜0.05)。NH脑部海马区DA的含量显著低于CON和CSP(P＜0.05)。对于脑部海马区五羟色胺的含量，NH显著高于CON和CSP(P＜0.05)。

表8 雏鸡脑部海马区神经递质含量Table 8 The content of neurotransmitters in hippocampus of NH3-stress broilers

3 讨论

氨气是危害畜禽养殖业最严重的有毒有害气体之一，给畜禽带来严重的应激反应，损害动物健康，损害养殖者乃至整个畜牧行业的利益。本研究中，100 mg/m3浓度的氨气环境下，雏肉鸡异常兴奋躁动、趴卧次数减少。雏肉鸡难以维持正常生理功能，最终表现为生长性能下降。

动物机体肠道平衡的菌群在机体能量摄取、代谢以及免疫系统调节等生命活动中发挥了重要作用[24]，且盲肠是禽类微生物的主要活性位点[25]。本文利用Illumina Hiseq高通量测序平台，探索氨气暴露及柴胡皂苷干预对雏肉鸡盲肠菌群的影响。微生物群落的整体结构和功能受到区系多样性与丰富度的调控，一旦失衡，肠道菌群将发生紊乱，从而诱发更多并发症。Zhu X.Y.等[26]研究表明，肉鸡盲肠微生物菌群的构建大概在6～7周，因此我们推测本试验中各组雏肉鸡盲肠菌群α多样性无显著性差异可能与试验肉鸡日龄及试验因素作用时间太短相关。β多样性则更注重对不同样本微生物群落构成进行差异分析，是外界环境对生物体改变程度的一个度量[27]。本试验中，氨气环境是影响雏鸡盲肠菌群β多样性的一个重要因素，柴胡皂苷的添加与否对雏鸡盲肠菌群β多样性的影响并不明显。

厚壁菌门是多种动物的肠道或粪便中主要的一种菌门，与畜禽的粗饲料转化率有关[28]，家禽的饲料配方中有谷物等粗饲料，厚壁菌门对其营养消化吸收有帮助作用。环境中高浓度氨气通过增加雏肉鸡盲肠中柔膜菌门含量，阻碍厚壁菌门在盲肠的定植，降低雏肉鸡对粗饲料的消化吸收能力，从而导致雏肉鸡生长发育迟缓。柴胡皂苷在饲料中的添加能在一定程度上维持肠道菌群的平衡，以抵抗氨气应激。

肠球菌科在宿主抵抗外界环境辐射中发挥重要作用，能够保护造血系统和胃肠道系统[29]。乳酸细菌科为常见益生菌科，具有改善胃肠道功能、提高食物消化率、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长等作用[30]。在科水平上，环境中高浓度氨气通过减少盲肠菌群中益生菌（乳酸细菌科、肠球菌科及厚壁菌门下一个未知科）的数量，打破微生物平衡，降低机体对外界应激源的抵抗力，损伤机体。

此外，环境中高浓度氨气还导致雏肉鸡盲肠菌群中有益菌属（瘤胃菌属和毛螺菌属）丰度减少，导致一些潜在的致病菌丰度相对增加，打破雏肉鸡肠道菌群平衡，从而对雏肉鸡机体造成损伤。瘤胃球菌属是鸡粪便中常见的菌，具有降解黏蛋白为动物提供碳和能量的功能[28]，氨气应激通过抑制该菌属的定植减少雏肉鸡对蛋白质的消化吸收，以抑制雏肉鸡生长。通过上述分析，氨气柴胡组微生物样本丰度更接近空白组，表明柴胡皂苷对环境高浓度氨气造成的肠道菌群紊乱有一定缓解作用。

“刺激-反应”理论是解释动物行为学变化最简单的理论，动物某些非正常行为的出现可能暗示了消极环境因素的存在。研究表明，现代育种技术的革新，经选育的商品肉鸡在整个生长过程中休息（趴卧）更多，以期通过减少活动量及能量消耗达到快速生长[31-32]。本试验中，高浓度氨气环境下肉鸡的趴卧频次显著减少，梳羽、抖身、展翅和走动的频次显著增加，表现为躁动不安，异常兴奋。从动物福利的角度，结果表明肉鸡在适应高浓度氨气环境遇到困难，使得肉鸡的品种特性行为不能正常发挥，严重降低了肉鸡的动物福利，不利于动物健康和生存。前人研究结果与本试验一致，鸡舍内高浓度的氨气阻碍肉鸡正常行为的表达，临床表现为好动、焦躁[31,33]。柴胡皂苷能在一定程度辅助肉鸡抵抗恶劣环境的应激，对保障肉鸡动物福利方面具有积极的作用。

神经生物学研究表明，大脑结构中，海马区既是应激反应的高级调节中枢，也是应激损伤靶区[34-35]。神经递质主要由神经系统分泌和释放，能反映中枢神经系统的功能活动和疾病状态[36]。DA被认为与脑组织兴奋和警觉性的保持相关。G.P.Chrousos研究表明，应激大鼠越兴奋，脑内DA释放量越多，应激初期达到峰值，随着时间的推移或者应激超负荷时，其功能下降[37]。5-HT主要参与情绪和冲动控制，前额叶皮质、海马等脑区5-HT在急性和慢性应激均被发现增加[38]。本试验中，高浓度氨气通过紊乱DA和5-HT系统功能危害雏肉鸡神经系统，雏肉鸡难以通过自身调节适应应激，表现出异常兴奋、惊恐症状[39]，进一步影响雏肉鸡正常生理生命活动，抑制其生长性能。柴胡皂苷的干预能在一定程度平衡神经系统的应激状态，改善雏肉鸡应激症状，抵抗氨气应激，推测与其镇静作用密切相关。

4 结论

①环境高浓度氨气通过影响肠道菌群β多样性，并在门、科及属水平上造成差异，进而打破肠道菌群的平衡，损害肉鸡健康。柴胡皂苷的干预能在一定程度调节并维持氨气应激下雏鸡肠道菌群的平衡，抵抗氨气对雏鸡造成的应激损伤。

②环境高浓度氨气通过引起雏肉鸡脑部海马区NE和5-HT激增，DA显著性降低，从而损害雏肉鸡的神经系统，异常兴奋、惊恐，表现为行为学好动焦躁，进一步影响雏肉鸡正常的生理活动，损害雏肉鸡的健康。柴胡皂苷的干预能对高浓度氨气引起的去甲肾上腺素激增有一定的缓解作用，通过发挥其镇静作用促使雏肉鸡抵抗氨气应激。