提高保乳手术送检皮肤切缘冷冻切片质量的体会

杨家莉，张 盛，王明伟，李 行，高少阳，唐 浩

术中快速冷冻病理诊断有助于外科医师术中快速决定下一步手术方案，目前已成为病理科的一项常规工作。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在各项指标均符合保乳要求时，越来越多的女性患者会选择保乳手术。保乳手术中最关键的一步为术中送检皮肤切缘，明确切缘有无癌组织侵犯，为保乳手术提供判断依据。但送检切缘组织中含有较硬的皮肤和皮下较软的脂肪组织，且较软的皮肤切缘在冷冻过程中会有不同程度的倾斜，从而导致制出的冷冻切片不全和褶皱。为克服上述困难，作者在实践中不断摸索，通过使用“冰垫”进行立埋和采用45°方向进行切片，能有效提高保乳手术皮肤切缘冷冻切片质量，从而减少因制片不全或褶皱导致的漏诊，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取2021年3～8月湖北省肿瘤医院病理科术中送检保乳手术切缘标本40例。

1.2 设备与试剂设备：冷冻切片机(Thermo NX70)，全自动HE染色机(HRS-18C)；试剂：胶水、AFA固定液、无水乙醇、二甲苯、分化液、返蓝液、苏木精、伊红等。

1.3 方法(1)将术中送检保乳手术皮肤切缘标本随机分为2组，每组20例，分别采用两种不同方法包埋。①传统组：组织样本托上滴加适量包埋剂，垂直放置皮肤切缘，在其周围加入适量包埋剂至全部覆盖组织，置于冷冻切片机内速冻；②改良组：在组织样本托头上加入1～2 mL胶水，置于冷冻切片机内，数秒后轻轻放置冰锤于胶水上，待胶水凝固后挪走冰锤，制成带有“冰垫”的托头。从冷冻切片机中取出预先制备好的带“冰垫”托头，垂直放置皮肤切缘，在其周围加入适量包埋剂至全部覆盖组织，置于冷冻切片机内速冻。两组均按同一方向进行切片、AFA固定、HE染色、中性树胶封固、镜检。由病理技师对40例冷冻切片染色结果进行盲法阅片，观察切片中组织缺损程度。(2)20例采用改良组包埋方法进行包埋的皮肤切缘，每例样本采用顺时针旋转样本头的方法，在两种不同角度下各切片1张。①水平面：皮肤表皮部分向上，真皮部分向下；②45°角：皮肤长轴与刀座呈45°角。两张切片均按照常规固定、染色、封固和镜检。由病理技师对20例冷冻切片的染色结果进行盲法阅片，观察切片中褶皱形成情况。无褶皱或有少量褶皱且不影响诊断计8～10分，有少量褶皱但影响诊断或有大量褶皱计5～7分，有大量褶皱且影响诊断计1～4分。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料用均值±标准差表示，采用Mann-WhitneyU检验比较两组组织缺损程度，采用Wilcoxon检验分析两组褶皱形成情况。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 包埋方法与切片质量传统组的切片大部分存在组织部分缺损，其完整度为(90.25±6.58)%，而改良组的切片组织缺损较少，其完整度为(97.00±3.77)%(图1)。与传统组相比，改良组的切片缺损程度较轻，差异有统计学意义(P=0.001)，这提示采用改良法进行包埋可提高送检皮肤切缘标本的冷冻切片完整度。

图1 两种包埋方法进行皮肤切缘冷冻切片情况比较：A.传统组；B.改良组

2.2 切片角度与切片质量对比观察采用两种不同角度进行切片的褶皱形成情况结果显示：水平面切片(7.45±0.95)，由于较硬的皮肤组织同时接触刀口，易造成组织的卷曲和褶皱；45°角切片(8.70±0.92)，组织逐渐接触到刀口，组织切片质量较高(P=0.001)。由此可见，采用皮肤长轴与刀座45°方向进行切片可减少送检皮肤切缘标本的冷冻切片褶皱。

3 讨论

目前，冷冻切片技术已成为病理科的常规工作之一，在病理诊断工作中发挥着不可忽视的作用。其原理是利用物理降温法，低温条件下快速将组织冷冻成硬块后进行切片的一种技术方法。冷冻切片可对手术过程中送检的组织作出精准的诊断，为外科医师术中手术方案的修订提供重要的临床依据。乳腺癌的发病率逐年增高且越倾于年轻化。与传统的乳腺癌改良根治术相比，保乳手术显著提高了患者术后的生活质量，并降低伤口感染风险[1]。保乳手术过程中，外科医师会切取各皮肤切缘送至病理科术中快速室。通过术中冷冻切片明确切缘是否有癌组织侵犯，准确评估切缘状态，具有重要的临床意义[2]。

送检乳腺皮肤切缘组织中通常含有皮肤、皮下乳腺和脂肪组织等。相较于其它组织，脂肪组织冷冻制片困难，是困扰病理技师的一大难题。丁伟等[3]采用二甲苯和无水乙醇等比例混合，大大改良了组织脱脂效果，但这一方法不适宜于冷冻切片。为提高脂肪组织的冷冻切片质量，通常采用降低样本温度、增加切片厚度或采用挤压等方法来实现[4-6]。然而，关于保乳手术送检切缘冷冻制片方法的相关文献报道极少。郑昕等[7]采用自上而下匀速切片替代常规的转轮切片，提高了保乳切缘冷冻切片的切片质量。杨会钗等[8]通过降低冷冻温度和增加切片厚度从而提高乳腺肿瘤及切缘冷冻切片质量。以上方法均可借鉴，然而作者在日常工作中发现送检皮肤切缘冷冻切片时常出现组织不全，进而易导致漏诊。分析原因发现：术中快速送检的新鲜皮肤组织由于其质地较软，在包埋剂冷冻的过程中，易倾斜或内陷，从而导致切片不全。在常规石蜡组织包埋中，对于需要立埋的组织，我们通常是先在包埋模具中加入少量的液体石蜡，待其底部凝固后，垂直放入组织，固定后加满液体石蜡进而完成包埋。受到这一启发，作者将术中送检的皮肤切缘垂直放置在带有“冰垫”的样品托上，再滴加胶水，由于“冰垫”的黏附和固定作用，可防止皮肤切缘组织在冷冻过程中出现倾斜和坍塌，从而达到立埋的效果。本实验通过对比分析发现，与传统法相比，使用“冰垫”可起到完全立埋的效果，大大提高了冷冻切片的组织完整度，可减少由于冷冻切片不全的原因所致的漏诊。

关于术中送检的皮肤切缘在冷冻切片时的切片角度目前尚无统一标准。《实用现代病理学技术》中指出，为得到相对优良的切片，需将组织硬脆的部分放在上端，从而有效防止组织出现裂痕、刀纹等现象，如皮肤组织，应将真皮部分向下[9]。马恒辉等[10]指出，遇到相对较硬的组织，包埋方向相当重要，否则很难切出一张完美的组织切片，建议沿着45°的方向进行切片，让刀片一点一点地接触到较硬的组织。然而，上述建议并未明确指出是否适用于术中快速组织标本切片，常规石蜡组织前期经过固定、脱水和浸蜡等处理，而冷冻组织仅经过低温速冻处理。因此，作者通过对两种不同角度进行切片实验，对比观察各自的冷冻切片质量，结果发现，45°角进行切片形成的褶皱相对较少，切片质量显著高于水平切片组。作者推测可能的原因是：水平面切片，由于较硬较脆的皮肤组织同时接触刀口，易造成组织卷曲。同时，作者在实验过程中也采用了垂直方向切片，结果发现切片质量不佳，可能是左右两边组织的质地不一致，从而容易使切片朝一侧弯曲，然而以上具体原因和机制需待进一步探究。

总之，术中送检的皮肤切缘在冷冻制片过程中，由于切片不全或褶皱从而导致了漏诊。本实验发现，使用“冰垫”能达到立埋效果，从而提高皮肤切缘的切片完整度。同时，采用45°方向进行切片，也可以大大减少切片褶皱的形成情况。该方法操作简便，效果良好，值得在日常的冷冻切片工作中推广使用。