结直肠癌中NAT10与上皮-间质转化的关系

刘英竹，程先硕，蔡昕怡，罗 含，江 凡，张丽娟

结直肠癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率在全球范围内均呈上升趋势。2020年全球癌症统计报告显示，结直肠癌的发病率位居第3位，病死率位居第2位[1]。流行病学调查显示，复发和转移是结直肠癌患者预后不良的关键性因素。肿瘤局限于结直肠的结直肠癌患者5年生存率约90%，而发生淋巴结或远处转移患者的5年生存率则会大幅降低[2]。肿瘤转移是一个涉及多基因变化的一系列复杂过程，其中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)使其从原发灶脱落而更具侵袭性，是其发生远处转移的关键步骤，是肿瘤侵袭转移的重要机制，其过程涉及包括Wnt通路在内的多条信号通路。目前已有研究证实[3]，结直肠癌的复发转移与EMT密切相关。N-乙酰基转移酶10(N-acetyltransferase 10, NAT10)是一种广泛存在于细胞内，由1 025个氨基酸组成的核蛋白，包含1个乙酰基转移酶结构域和1个富含赖氨酸的羧基末端。NAT10在正常组织中表达定位于核仁中；而在肿瘤细胞中，NAT10存在易位表达如细胞核、细胞质、细胞膜。目前已有研究表明[4]，NAT10表达上调可促使EMT进而导致肝细胞性肝癌的转移。然而，NAT10在结直肠癌中研究甚少。因此，本实验采用免疫组化法检测NAT10、E-cadherin、β-catenin、vimentin在结直肠癌中的表达，探究NAT10表达与结直肠癌EMT的相关性及与临床病理特征的关系，旨在为探索结直肠癌患者新的抗肿瘤治疗方法提供线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集云南省肿瘤医院2016年8月～2021年9月存档的原发性结直肠腺癌根治性标本95例作为实验组，30例癌旁正常组织(距离癌组织5 cm以上的正常肠黏膜组织)作为对照组。95例结直肠腺癌中，男性55例，女性40例；<50岁者21例，≥50岁者74例；高+中分化62例，低分化33例；肿瘤浸润至T1(黏膜下层)14例，T2(固有肌层)34例，T3(浆膜下层)有46例，T4(穿透浆膜层)1例；淋巴结转移：N0(无淋巴结转移)48例，N1(淋巴结转移数3枚及以下)34例，N2(淋巴结转移数4枚及以上)13例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期44例，Ⅲ+Ⅳ期51例；无脉管内癌栓或神经侵犯57例，有脉管内癌栓或神经侵犯38例；无远处转移80例，有远处转移15例。入组标准：(1)经病理诊断证实初诊为结直肠腺癌的根治术术后标本；(2)患者术前未行放、化疗及靶向治疗；(3)未合并其它恶性肿瘤；(4)有完整的临床病理资料。

1.2 主要试剂E-cadherin、β-catenin、vimentin鼠抗人单克隆抗体均购自福州迈新公司，免疫化检测试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新公司。NAT10购自Abcam公司。

1.3 免疫组化标本均经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片。NAT10抗体为浓缩液，1∶2 000比例稀释。将已知阳性组织切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。一抗包括NAT10、E-cadherin、β-catenin、vimentin，免疫组化采用MaxVision 3HRP法，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 结果判读

1.4.1NAT10判读 NAT10在正常结直肠黏膜组织中表达定位于细胞核核仁，因此当≥10%的结直肠腺癌细胞呈细胞质、细胞核及细胞膜易位表达时，即判定为阳性[5]。

1.4.2E-cadherin、vimentin判读 观察高倍(400×)视野下阳性细胞数及染色强度。随机选取5个高倍视野，计数至少200个细胞。细胞未染色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐为3分。总评分=不同染色状态的细胞数×对应的染色评分。将E-cadherin评分<200称为表达下降，将vimentin评分>30称为表达上调。本实验将E-cadherin表达下降称为阴性，反之称为E-cadherin阳性；将vimentin表达上调称为阳性，反之称为vimentin阴性。结果判定由2名医师采用双盲法读片确定。

1.4.3β-catenin判读 β-catenin在正常结直肠黏膜组织中表达定位于细胞膜，在结直肠腺癌中存在细胞质及细胞核异位表达。本实验采用Maruyama等[6]的方法，即当10%及以上的细胞出现细胞核或细胞质表达时称为异位表达，即阳性；反之则为阴性。

1.5 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学处理，计数资料的比较采用χ2检验或费希尔精确检验，采用斯皮尔曼对NAT10及EMT相关标志蛋白的表达进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠腺癌和正常肠黏膜组织中NAT10的表达在30例正常肠黏膜组织中，有90%(27/30)的NAT10表达定位于细胞核核仁(图1)；在95例结直肠腺癌组织中，有70.5%(67/95)出现细胞核及细胞质阳性(图2)，29.5%(28/95)为阴性或细胞核核仁阳性。

2.2 结直肠腺癌与正常肠黏膜组织中E-cadherin、β-catenin、vimentin的表达结直肠癌组织中E-cadherin呈阳性(图3)，阳性率为56.8%(54/95)；在正常肠黏膜组织中，E-cadherin阳性率为96.7%(29/30)，结直肠癌组织中E-cadherin的阳性率明显低于正常肠黏膜组织(P<0.001)。结直肠癌组织中β-catenin呈阳性(图4)，阳性率为74.7%(71/95)；在正常肠黏膜组织中，β-catenin阳性率为0(0/30)，结直肠癌组织中β-catenin阳性率明显高于正常肠黏膜组织(P<0.001)。结直肠癌组织中vimentin呈阳性(图5)，阳性率为35.8%(34/95)；在正常肠黏膜组织中vimentin阳性率为0(0/30)，结直肠癌组织中vimentin阳性率明显高于正常肠黏膜组织(P<0.001，表1)。

表1 结直肠腺癌及正常肠黏膜组织中E-cadherin、β-catenin及vimentin的表达

2.3 结直肠腺癌中NAT10与E-cadherin、β-catenin、vimentin表达的相关性在结直肠腺癌组织中，E-cadherin、β-catenin、vimentin的阳性率分别是56.8%、74.7%、35.8%。相关性分析显示，NAT10与E-cadherin表达呈负相关，与vimentin、β-catenin表达呈正相关(表2)。

表2 结直肠腺癌中NAT10与E-cadherin、β-catenin及vimentin表达的相关性

2.4 结直肠腺癌中NAT10表达与临床病理特征的关系NAT10表达与结直肠腺癌分化程度、淋巴结转移、浸润深度及pTNM分期相关(P<0.05)，与患者年龄、性别、神经及脉管侵犯、远处转移均无关(P>0.05，表3)。

表3 结直肠腺癌中NAT10表达与临床病理特征的关系

3 讨论

NAT10是乙酰基转移酶GCN5相关N端乙酰基转移酶超家族成员，具有组蛋白和非组蛋白乙酰基转移酶功能[7]。近年来，研究显示NAT10参与人体内的若干种生理及病理生理过程，如调控mRNA稳定性及翻译效率、调控端粒酶活性、调控细胞周期进展等，且在细胞增殖、细胞迁移、DNA损伤反应和EMT中均有作用，因此NAT10可能是治疗癌症的潜在靶点[8-9]。NAT10在淋巴组织、肾脏、肝脏、小脑、大脑皮层和胚胎时期的中枢神经系统等组织中广泛表达。在功能正常的细胞中，其表达定位于核仁；在肿瘤组织中，其存在易位表达，常位于细胞核、细胞质等。这种易位表达机制尚不完全清楚，可能是由同时缺失68-75、989-1018两个基因片段所导致[10]。

Zhang等[5]研究表明，NAT10过表达可增加结直肠癌细胞活动度，促进肿瘤侵袭、转移，与结直肠癌预后关系密切，且NAT10的易位表达模式也与结直肠癌分化程度及预后相关。低分化、预后差的结直肠腺癌中，NAT10更倾向于细胞膜表达；而中+高分化、预后相对较好的结直肠腺癌倾向细胞质、细胞核表达及联合表达。这种易位表达与预后的相关性在透明性肾细胞癌、肝细胞性肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、软组织肉瘤中曾得到证实[11]。但也有研究表明[12]，结直肠癌组织中NAT10表达水平较正常组织明显降低，且在结直肠腺癌、胃腺癌、胰腺腺癌中，NAT10水平与E-cadherin水平呈正相关。本实验与Zhang等[5]的研究结论一致，认为NAT10过表达可增加结直肠癌细胞活动度，但本实验中并未出现细胞膜的表达模式，可能与病例数较少和组织差异有关。

在生理状态下，正常组织中上皮细胞间具有强大的黏附能力，使其紧密相连，难以发生转移。而当上皮细胞丧失了原来特性，转化为疏松排列的具有间质细胞特性的细胞时，EMT就此产生，其是肿瘤突破基膜，发生转移的重要步骤。有研究表明[13-14]，EMT在多种恶性肿瘤如结直肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、肝细胞性肝癌、骨肉瘤、多发性骨髓瘤、舌鳞状细胞癌中均有发生。在宏观方面，EMT表现为细胞形状的改变，由原先排列紧凑的圆形或立方形上皮细胞变为排列疏松的梭形细胞，并伴有迁移游走能力增强。微观表现为上皮表型标志物如：E-cadherin、膜性β-catenin的表达减少，同时间质细胞分子标志物如vimentin、N-cadherin、MMPs等表达增加。其中β-catenin核异位可负性调控膜相关性E-cadherin/β-catenin复合物，使肿瘤细胞间的黏附能力下降，从而增强肿瘤细胞侵袭转移能力。本实验中，与正常肠黏膜组织相比，结直肠腺癌组织中E-cadherin表达降低，vimentin及β-catenin表达增加且差异具有统计学意义。

在肝细胞性肝癌中，有研究发现[4]通过转染NAT10-siRNA或Remodelin处理抑制NAT10活性后，肿瘤细胞成瘤能力减低，同时E-cadherin表达升高，而vimentin表达下降，表明下调NAT10表达可抑制EMT的发生发展。此外，在乳腺癌[15]中也可得到类似结论：即用Remodelin抑制剂处理NAT10后，发现E-cadherin表达升高，而vimentin表达降低。Zhang等[5]研究表明，在结直肠癌中存在胞质、胞核、胞膜的NAT10染色与β-catenin的细胞核易位表达呈正相关。本实验虽然未出现NAT10的膜性表达，但NAT10易位表达与β-catenin异位表达间存在显著正相关；NAT10表达与结直肠癌分化程度、浸润深度、pTNM分期和淋巴结转移相关，进一步说明了结直肠癌中NAT10与EMT间存在显著相关性，与既往研究相符。

综上，NAT10在结直肠腺癌中存在显著的易位改变，并与EMT间存在正相关。NAT10通过诱导结直肠癌EMT，从而促进肿瘤细胞侵袭、转移，但其中涉及的分子、通路由于相关研究较少，尚不十分清楚，有待于进一步探索。目前已存在的NAT10小分子抑制剂Remodelin对NAT10的活性具有明显的抑制作用，已在体外肝细胞性肝癌及乳腺癌细胞株中被证实，且已应用于临床基础研究中，有望向临床转化应用。结直肠腺癌的治疗手段虽然比较广泛，但复发、转移仍是预后不良的关键性因素和主要死因。因此，深入探究NAT10在结直肠癌中侵袭转移的分子机制在未来结直肠癌的临床治疗中具有重要意义。