乳腺导管原位癌三级淋巴结构的临床病理特征分析及其与肿瘤进展的关系

黄东东，邬万新,，陈彩萍，左志博，张 琳，王 振，郭志琴，袁琳娜，汪静宇

乳腺浸润性导管癌(infiltrating ductal carcinoma, IDC)是由导管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)经过微小浸润性癌(ductal carcinoma in situ with microinvasion, DCIS-MI)发展而来[1-2]。在DCIS发展成IDC的过程中，宿主局部免疫功能起着重要作用，三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures, TLS)就是其中重要的免疫功能结构[3-4]。目前，对于TLS在乳腺DCIS浸润和进展过程中的作用尚不明确。因此，本文着重探讨乳腺DCIS中TLS的临床病理特征，分析其与肿瘤浸润的关系，为临床与病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集嘉兴市第一医院2011年12月～2017年12月收治的103例DCIS、32例DCIS-MI和78例IDC手术标本。所有病例均经病理确诊，术前未接受放、化疗且有临床随访资料。随访截至2021年4月30日。DCIS和DCIS-MI患者随访3～108个月(中位随访时间68个月)，平均年龄(53.85±9.72)岁；IDC患者随访6～112个月(中位随访时间56个月)，平均年龄(54.69±10.94)岁。

1.2 方法

1.2.1组织学分组及分型 参照WHO(2019)乳腺肿瘤分类的标准分别定义DCIS、DCIS-MI和IDC及进行分子分型[5]。乳腺癌分子分型为Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型和三阴型。

1.2.2免疫组化 采用EnVision两步法行免疫组化染色。主要试剂：CD3(兔单抗，EP41，1∶100)、CD21(兔单抗，EP64，1∶200)和BCL-6(鼠单抗，ZM-0011，1∶200)购自北京中杉金桥公司；CD20(鼠单抗，L26，即用型)购自福州迈新公司；PNAD(鼠单抗，MECA-79，1∶50)购自美国SANTA CRUZ公司。采用已知的阳性或内对照组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。应用全自动免疫组化仪(Roche Benchmark XT, USA)执行免疫组化染色流程。

1.3 结果判读TLS判读标准：(1)判读区为癌灶内及其周围≤5 mm间质区域；(2)出现淋巴细胞聚集灶，且有CD3和CD20阳性细胞；(3)聚集灶内可见高内皮小静脉(high endothelial venules, HEV)，且PNAD阳性；(4)聚集灶内伴或不伴生发中心，有或无CD21阳性滤泡树突状细胞(follicular dendritic cell, FDC)、BCL-6阳性生发中心细胞 (germinal center cell, GC)[6-7]。

TLS密度分级：(1)在DCIS及DCIS-MI中，将TLS按照导管周围含有TLS的导管数量占DCIS总导管数量的百分比进行分级：无、低(含TLS的DCIS导管<10%)、中等(含TLS的DCIS导管10%～50%)、高(含TLS的DCIS导管>50%)[6-7]。(2)在IDC中，以TLS占据癌灶周长的百分比进行分级：无、低(TLS占据癌灶周长<10%)、中等(TLS占据癌灶周长10%～50%)、高(TLS占据癌灶周长>50%)[6,8]。

1.3 统计学方法所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。组间差异比较采用Pearson χ2检验或Fisher精确概率方法。生存分析采用Kaplan-Meier。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLS的特征及在DCIS、DCIS-MI和IDC中的分布在DCIS、DCIS-MI和IDC中，TLS均以淋巴细胞聚集灶形式存在，CD3+细胞围绕TLS周边，CD20+细胞主要位于GC及套区，PNAD+HEV存在于TLS内部(图1)。TLS在DCIS和DCIS-MI中主要分布于导管周围，在IDC中主要分布于浸润灶周边。

图1 同一导管原位癌病例连续切片：A. TLS的组织结构，HE染色；B.CD3+T淋巴细胞，EnVision两步法；C.CD20+B淋巴细胞，EnVision两步法；D. CD21+滤泡树突状细胞，EnVision两步法；E. BCL-6+生发中心细胞，EnVision两步法；F. PNAD+高内皮小静脉，EnVision两步法

2.2 TLS与DCIS、DCIS-MI和IDC临床病理特征的关系103例DCIS中，不同核级组间TLS密度差异有统计学意义(P<0.001，表1)，随着核级的增高DCIS中TLS高密度数增高。DCIS伴有坏死组较无坏死组的TLS高密度数增高(χ2=41.127，P<0.001)。DCIS不同分子分型组间TLS密度差异有统计学意义(P<0.001)，其中HER-2过表达型DCIS中TLS高密度比例最高。32例DCIS-MI中，不同分子分型(P=0.019)、核级(P=0.007)分组间TLS密度差异有统计学意义，随核级的增高DCIS中TLS高密度数增高(表1)。

表1 TLS密度与乳腺导管原位癌及乳腺导管原位癌伴微浸润临床病理特征的关系

TLS在DCIS中的发生率78.6%(81/103)，在DCIS-MI中的发生率96.9%(31/32)，两组差异有统计学意义(χ2=21.680，P<0.001)，且在DCIS-MI中高于DCIS。

78例IDC中，不同组织学分级(P<0.001)、核级(P=0.016)、肿瘤直径(P<0.001)、淋巴结转移(P=0.043)和分子分型(P=0.001)分组间差异有统计学意义，并随组织学分级增高、核级增高、肿瘤体积增大和淋巴结转移时TLS密度增高，其中HER-2过表达型IDC中TLS高密度比例最高(表2)。

表2 TLS密度与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系

2.3 TLS与乳腺癌患者预后的关系三组病例临床随访中均无局部复发。DCIS和DCIS-MI组有3例发生肺或骨转移，2例死于乳腺癌。IDC组有5例发生肺、骨或脑转移，3例死于乳腺癌。生存分析显示：在DCIS及DCIS-MI中(图2A)，有TLS组和无TLS组患者的5年生存率分别是99.3%和100.0%，差异无统计学意义(P=0.518)。在IDC中(图2B)，有TLS组和无TLS组患者的5年生存率分别是94.2%和100.0%，差异无统计学意义(P=0.220)。

图2 A.有TLS组和无TLS组的乳腺导管原位癌、乳腺导管原位癌伴微浸润患者的生存率；B.有TLS组和无TLS组的浸润性导管癌患者的生存率

3 讨论

TLS是在原没有淋巴组织聚集的部位出现的一种获得性免疫功能结构，目前认为它是肿瘤局部免疫的关键因素[3]。本研究中78.6%DCIS的导管周围存在密度不等的TLS，且随着DCIS核级的增高或伴有坏死时，导管周围TLS的密度增大。Pruneri等[9]发现DCIS中64.8%病例的导管周围存在不同程度的淋巴细胞浸润，并且DCIS的核级越高，出现围管型淋巴细胞浸润现象越明显。同时，有研究[10-11]在对DCIS免疫微环境的研究中发现：导管周围淋巴细胞浸润与肿瘤细胞基因组高拷贝数和p53突变有关，此类肿瘤细胞较易产生新的肿瘤抗原，吸引免疫细胞的浸润，并在形态学上其常表现为高核级和坏死改变。

本组中96.9%的DCIS-MI导管周围存在TLS，密度明显高于DCIS组；其中DCIS成分大部分是高核级，表明大多数DCIS-MI来自高核级DCIS，且伴随导管周围TLS密度增加，微小浸润癌发生率也增加。Beguinot等[12]在研究DCIS和DCIS-MI关系时发现：DCIS存在2种不同亚型，其中伴有高密度淋巴细胞浸润的DCIS在生物学上与DCIS-MI类似，认为DCIS-MI更多的是来自于伴有淋巴细胞浸润的DCIS。Kim等[7]在对DCIS-MI的研究中同样发现TLS数量明显多于单纯性DCIS。Yuan等[13]在对乳腺癌的研究中发现，癌灶局部浸润的淋巴细胞对肌上皮具有破坏作用，利于肿瘤细胞浸润的发生。因此，TLS可能与DCIS肿瘤细胞早期浸润的发生有关。

本组IDC病例随着癌灶周围TLS密度的增加，肿瘤的组织学分级增高，体积增大，并更易出现淋巴结转移，提示TLS可能与乳腺癌组织学不良预后因素相关。Toss等[14]在192例同时含有IDC与DCIS成分的乳腺癌病例中发现，浸润性癌区域出现了高密度的淋巴细胞浸润。Sofopoulos等[15]随访了112例乳腺IDC患者，与缺乏TLS的患者相比，瘤周存在TLS患者的无瘤生存期和总生存期均较差，认为TLS是预后不良的因素。

在乳腺癌分子分型与TLS密度关系中，DCIS和IDC中HER-2过表达型病例的TLS密度均高于其他亚型，提示HER-2阳性癌细胞可能更易激活免疫系统反应，在癌灶局部产生TLS。Kim等[7]研究也发现TLS与HER-2过表达/激素受体阴性表型有关。HER-2过表达型乳腺癌出现较多TLS的原因，可能与此型乳腺癌表达可吸引免疫细胞浸润的HMGB1和HMGN1蛋白有关[16]。

目前，有关TLS与乳腺癌患者预后关系的研究结果尚不一致。有研究表明IDC瘤周存在的TLS是预后不良因素[17]；但在三阴型或HER-2过表达型乳腺癌的研究中发现TLS是预后良好指标[6,17]。这些差异可能与上述研究所涉及的乳腺癌类型不同有关，TLS常见于三阴型或HER-2过表达型的高侵袭性乳腺癌，当与低侵袭类型乳腺癌比较预后时，可能癌细胞本身起决定性作用；而在同一类型乳腺癌中，TLS就可能成为预后有利的因素。本研究未观察到TLS对乳腺癌预后的影响，可能与样本量少和随访时间有限有关。

综上，乳腺DCIS出现高核级、坏死和HER-2过表达时常伴有TLS的形成，并且TLS与DCIS早期浸润相关。进一步研究DCIS导管周围TLS的免疫细胞组成及效应关系，可为乳腺癌早期抑制肿瘤进展方面提供新的思路。