胃癌中TRIM11的表达及其对PI3K/Akt信号通路的影响

都向阳，袁 伟，任 磊，侯英勇

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，具有发病率、病死率高的特点[1-2]。流行病学调查显示：2015年我国新发胃癌患者40万，死亡患者约29万，严重危害人类生命健康[3]。目前有关胃癌的治疗方式主要包括手术和放、化疗，其中手术治疗仍然是胃癌患者获得良好预后的关键，然而胃癌的发病机制较为复杂，病死率仍较高[4-5]。

三结构域蛋白11(tripartite motif containing 11, TRIM11)是TRIM家族蛋白成员之一，广泛参与细胞凋亡、增殖，对细胞周期调控起重要作用[6]。TRIM11作为一种促癌因子，可以通过多途径促进肿瘤细胞增殖和侵袭[7]。在分期较高的胶质瘤中TRIM11呈高表达，低分化以及预后良好的胶质瘤中TRIM11呈低表达[8]。另外，TRIM11能够通过激活MAPK信号或PI3K/Akt信号促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[9-10]。目前，有关TRIM11在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖和凋亡等生物学功能及其潜在的分子机制尚不清楚。因此，本文拟通过分析胃癌组织中TRIM11的表达及其与胃癌临床病理特征的相关性，并进一步通过体外细胞实验探讨TRIM11对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其潜在分子作用机制，以期为胃癌患者提供新的诊断标志物和潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 收集2018年1月～2021年1月复旦大学附属中山医院行手术肿瘤切除治疗，且随访资料和病理资料均完整的胃癌标本120例。胃癌癌组织及其癌旁正常组织(距离肿瘤边缘3 cm以上)样本经手术切除后迅速分块放置于液氮罐内冻存或经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋保存。患者病理信息由我院病理医师复诊确诊。

1.1.2主要试剂 免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥公司)；qTR-PCR检测试剂盒(日本Takara公司)；引物设计与合成(上海生工生物工程公司)；转染试剂盒(广州锐博公司)；TRIM11兔单克隆抗体、PI3K小鼠多克隆抗体、Akt兔多克隆抗体(英国Abcam公司)；HRP标记山羊抗兔二抗、HRP标记山羊抗小鼠二抗、EdU细胞增殖检测试剂盒、BCA试剂盒、ECL显影液(碧云天公司)。

1.1.3仪器 细胞匀浆仪(武汉泰普拓公司，型号TWK-FST32)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技中国公司，型号Micro17R)；倒置荧光显微镜(日本尼康公司，型号GPJ9-TS100-F)；全自动多功能酶标检测仪(赛默飞世尔科技中国公司，型号FC)；电泳仪(美国伯乐Bio-Rad公司，型号1658033)；ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫组化检测TRIM11表达 石蜡样本4 μm厚切片，按照免疫组化EnVision法染色试剂盒进行操作。3%H2O2孵育10 min消除内源性过氧化物酶，85 ℃抗原修复，加入10%BSA封闭20 min。加入TRIM11小鼠单克隆抗体(稀释比1∶200)，4 ℃孵育过夜。加入对应HRP标记的山羊抗小鼠二抗，室温下孵育30 min。滴加DAB显色液显色，其中TRIM11阳性区域存在明显的棕色颗粒沉着。免疫组化结果判定：细胞膜无阳性着色或着色<10%为阴性；细胞膜着色≥10%为阳性。

1.2.2细胞培养与转染 人胃黏膜上皮细胞GES-1购于北京肿瘤研究所，人胃癌细胞株AGS、HGC-27、BGC-82购自ATCC公司，将含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。当AGS细胞生长融合度达60%～70%时，使用质粒3000转染试剂盒分别转染TRIM11无关片段(TRIM11-NC组)以及TRIM11干扰片段(TRIM11-siRNA组)。依据转染试剂盒说明书进行相关操作，其中TRIM11-NC序列：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGU-3′；TRIM11-siRNA序列：5′-GCG UGCAAGUGGACGUUAATT-3′。Control组细胞常规(含10%FBS的DMEM培养基)培养24 h。

1.2.3qRT-PCR检测TRIM11 mRNA表达水平 取液氮罐内冻存的胃癌组织样本，经液氮研磨后，加入TRIzol裂解液提取组织样本总RNA，将RNA逆转录成cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行TRIM11 mRNA表达扩增，以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算得出TRIM11 mRNA的相对表达量。TRIM11引物序列：上游5′-TGCCAGCTGCTTAAA CATTC-3′，下游5′-GTGGCTGAGCTCTTCTGTCG-3′。β-actin引物序列：上游5′-CCATCACCATCTTCCAG GAG-3′，下游5′-CCTGCTCACCACCTTCTTG-3′。以胃癌组织TRIM11 mRNA表达平均值为界，将TRIM11 mRNA表达分为高表达组和低表达组。

1.2.4EdU染色检测胃癌细胞增殖 取对数生长期胃癌细胞，按照(0.4～1)×104个/孔接种至96孔板内，培养至正常生长阶段。(1)EdU标记：细胞培养基∶EdU溶液按照1 000∶1的比例制备EdU稀释液；(2)每孔加入100 μL EdU培养液孵育2 h，倾去培养基；(3)PBS浸洗细胞1～2次，每次3 min；(4)每孔加入100 μL细胞固定液，室温固定20 min；(5)PBS浸洗细胞1～2次，每次3 min；(6)每孔加入100 μL DAPI染液，避光、室温、脱色摇床孵育约20 min，倾去细胞染液；(7)每孔每次加入100 μL PBS浸洗1～3次，于100倍显微镜下观察着色情况并拍照。胃癌细胞增殖指数(%)=EdU阳性细胞数/细胞核总数×100%。

1.2.5流式细胞术检测胃癌细胞凋亡 细胞转染TRIM11-NC或TRIM11-siRNA 24 h后，收集各组细胞，PBS浸洗3次，离心后倾去细胞液，细胞重悬将浓度调整为1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书操作，在488 nm处分别激发525 nm和620 nm带孔滤波器，检测FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)荧光，从而得到三组胃癌细胞的凋亡情况。

1.2.6Western blot检测TRIM11、PI3K、Akt的表达 收集各组细胞；4 ℃条件下裂解30 min，期间每隔5 min震荡1次；BCA法测定蛋白质浓度；凝胶电泳；湿转转膜；上样；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入TRIM11小鼠单克隆抗体(1∶1 000)，PI3K小鼠多克隆抗体(1∶1 000)，Akt兔多克隆抗体(1∶1 000)以及β-actin抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，加入对应HRP标记的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗((1∶5 000)孵育1～2 h；摇床上摇晃，TPBS洗涤5 min×3次，加入显影液，显影并拍照。

2 结果

2.1 胃癌组织中TRIM11蛋白表达水平癌旁正常胃黏膜组织中TRIM11阳性率11.7%(14/120)，胃癌癌组织中TRIM11阳性率为80.8%(97/120)，TRIM11表达显著高于癌旁组织(P<0.01，图1)。

图1 胃组织中TRIM11蛋白表达水平，EnVision法：A.癌旁组织；B.癌组织

2.2 胃癌组织中TRIM11 mRNA表达及与临床病理特征的关系胃癌组织中TRIM11 mRNA高表达68例，低表达52例。胃癌组织中TRIM11 mRNA表达与临床分期、淋巴结转移及浸润深度均有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、远处转移及分化程度均无关(P>0.05，表1)。

表1 TRIM11 mRNA表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 胃癌细胞中TRIM11 mRNA表达水平与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，胃癌细胞系HGC-27、BGC-823和AGS中TRIM11 mRNA表达水平显著升高(P<0.05，图2)。其中AGS中TRIM11 mRNA表达水平最高，应用该细胞株进行后续实验。

图2 正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞中TRIM11 mRNA表达：与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 转染TRIM11-siRNA对胃癌细胞增殖的影响转染TRIM11-siRNA后，Western blot检测TRIM11蛋白表达水平结果显示：与Control组相比，TRIM11-siRNA组细胞TRIM11蛋白表达显著降低(P<0.01)，TRIM11-NC组无显著变化(P>0.05，图3)。EdU检测显示：与Control组相比，转染TRIM11-siRNA组细胞增殖显著降低(P<0.01)，转染TRIM11-NC组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

图3 Western blot检测TRIM11蛋白表达水平：与Control组相比，**P<0.01

图4 EdU检测胃癌细胞增殖情况：与Control组相比，**P<0.01

2.5 转染TRIM11-siRNA对胃癌细胞凋亡的影响流式细胞术检测显示：与Control组相比，转染TRIM11-siRNA组细胞凋亡指数显著升高(P<0.01)，转染TRIM11-NC组细胞凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05，图5)。

图5 流式细胞术检测胃癌细胞凋亡情况：与Control组相比，**P<0.01

2.6 转染TRIM11-siRNA对胃癌细胞PI3K/Akt信号的影响Western blot检测显示：与Control组相比，转染TRIM11-siRNA组细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量均显著降低(P<0.01)，转染TRIM11-NC组细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量无显著变化(P>0.05，图6)。

图6 Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达：与Control组相比，**P<0.01

3 讨论

TRIM11作为TRIM基因家族成员之一，其在多种疾病中的作用日益受到重视。TRIM11不仅可维持机体的正常生理状态(如细胞生长、细胞分化以及细胞凋亡等)，而且还参与了多种疾病的发生发展，如肿瘤和神经系统疾病等[11-12]。新近研究发现，TRIM11能够调控肿瘤细胞的增殖和凋亡，进而影响肿瘤的进程[13]。然而，目前有关TRIM11在胃癌发生、发展中的机制尚不清楚。

既往研究证实，TRIM11可通过激活MAPK信号通路，促进骨肉瘤细胞增殖，延长细胞周期[10]。另外，在肝癌组织中TRIM11表达显著升高，且TRIM11表达水平与肝癌患者疾病进展及预后呈负相关，提示TRIM11可能是肝癌患者治疗的潜在靶点[14]。本研究首先通过免疫组化检测TRIM11在120例手术切除胃癌组织及癌旁正常组织中的表达，结果显示与癌旁正常组织相比，胃癌组织中TRIM11阳性细胞比例显著升高，表明TRIM11表达与胃癌疾病进展可能存在一定的相关性。本组检测TRIM11 mRNA表达并对其与临床病理特征的关系进行分析，结果显示TRIM11 mRNA表达与胃癌临床分期、淋巴结转移以及浸润深度均有相关性，而与患者年龄、性别、远处转移及分化程度均无关，提示TRIM11可能是胃癌疾病发生、发展的潜在靶标分子。细胞增殖和凋亡的失衡是肿瘤细胞恶性生长和病变关键环节[15]。既往研究显示敲低TRIM11能够抑制结直肠癌细胞HT29增殖，促进凋亡[16]。因此，本研究进一步通过体外细胞实验探讨TRIM11对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，结果显示与正常胃黏膜上皮细胞相比，胃癌细胞系TRIM11 mRNA表达水平显著升高，与文献报道一致。与Control组相比，TRIM11-siRNA组细胞TRIM11蛋白表达显著降低，表明胃癌细胞转染TRIM11-siRNA成功。EdU和流式细胞术检测显示：与Control组相比，转染TRIM11-siRNA组细胞增殖指数显著降低，凋亡指数显著升高，表明TRIM11能够促进胃癌细胞增殖，抑制凋亡。PI3K/Akt信号转导在在胃癌细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[17]。研究显示激活PI3K/Akt信号转导能够促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡[18]。另外，PI3K/Akt信号通路的激活促进MMP-2表达增加，活性增强，从而介导细胞外基底膜胶原降解，并最终促进胃癌细胞向外周围浸润，促进细胞侵袭和转移[19]。因此，针对PI3K/Akt信号通路靶向治疗越来越受到研究者的关注。本研究通过Western blot检测显示：与Control组相比，转染TRIM11-siRNA组细胞p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均显著降低，表明TRIM11能够通过激活PI3K/Akt信号传导，促进胃癌细胞增殖，抑制凋亡。

综上，胃癌组织中TRIM11呈高表达，且其与胃癌的恶性病理因素相关，TRIM11能够通过PI3K/Akt信号促进胃癌细胞增殖，抑制细胞凋亡。本研究仍存在一定不足，实验仅从细胞层面上初步揭示了TRIM11对胃癌增殖和凋亡的影响和机制，未在动物实验进一步验证。为此在后续的研究中将通过构建胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型，明确TRIMM11对移植瘤生长作用，为胃癌诊断和治疗提供可靠的实验依据。