基于不同工艺柑普茶有效成分含量及抗氧化研究

何淑欣，罗琼，薛巧如，洪群华，周满如*，张素中*

1. 广州新华学院 药学院（广州 5105202）；2. 广东省药品检验所（广州 510663）

柑普茶，又名新会柑普洱茶，是由广东新会大红柑或小青柑和云南西双版纳勐海县普洱茶为原料制作而成的一种茶，其特点入口甘醇、香甜，有独特的陈香味，保健作用突出，受到广大消费者的喜爱。柑普茶采用纯天然的新会柑（国家地理标志保护产品，一般采用未成熟青柑除去果肉）和云南普洱茶（国家地理标志保护产品）为原料，在没任何添加剂的情况下，经纯生晒、半生晒制作而成。

新会柑主要成分为黄酮类化合物、挥发油、生物碱以及多糖。近年来柑普茶产业迅速发展，茶企品牌不断增多，新会小青柑普洱茶制备工艺多，但是目前关于新会小青柑普洱茶不同制备工艺及其功能作用研究报道较少。因此，加快探讨不同制备工艺的新会小青柑普洱茶中没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素的含量及其抗氧化活性的差异显得十分必要。

该试验以新会核心产区之一天马新会柑为研究对象，探索新会小青柑普洱茶制备的最佳条件。采用正交试验方法，以没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素等物质含量为考察指标，对新会柑普茶的不同制备工艺进行评价，并进一步通过DPPH法对不同发酵条件下新会小青柑普洱茶进行总黄酮抗氧化活性分析，为新会小青柑普洱茶的制备工艺及推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品与试剂

样品：小青柑采摘时间为五月份，直径大小为5 cm左右，为2018年江门新会陈皮核心产区天马的小青柑9年驳枝柑（由江门市新会区捷和茶业有限公司、江门市新会区葵陈茶业有限公司、江门市新会区君厚茶业有限公司提供），见表1，茶叶来源为云南普洱茶熟茶（茶号：79562）。

表1 样品来源

川陈皮素对照品（批号：C-015-180306，来源：成都瑞芬思生物科技有限公司）、桔皮素对照品（批号：J-022-181216，来源：成都瑞芬思生物科技有限公司）、没食子酸对照品（批号：110831-201605，来源：中国食品药品检定研究院）、咖啡因对照品（批号：026PTO，来源：EPRS），DPPH（批号：STBC5115V），试剂盒购自广州赛沫生物科技有限公司。

试剂：甲醇（色谱纯，Honeywell）；磷酸（分析纯，广州试剂厂）。

1.2 主要仪器与设备

AE1204电子分析天平（上海良平）；XB220A电子分析天平（瑞士PRECISA）；KQ-300DE型数控超声器（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-50手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；超纯水发生器（Milli-Q Advantage A10）、移液器20-200 μL（Finnpipette）；V-1800可见分光光度计[翱艺仪器（上海）有限公司]；ELx808TM酶标仪（美国BioTek）；TG16W微量高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；TGL16M台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；SpectraMax M3多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]。

1.3 制备工艺

1.3.1 半生晒法

采摘柑青皮（青皮）时期的新会柑，在果体顶部开口，利用工具将其柑肉挖出，只留下果壳，用水清洗干净，晾干（不可以暴晒）；填充茶叶，取普洱熟茶均匀填充进柑容器本体内；高温杀青：茶叶填充后，将柑容器本体放置在高温蒸汽中进行杀青，控制温度为90～98 ℃，时间为8～15 min，得到初柑普茶；常温冷却（晒）：将提香后的初产品在温度20～30 ℃下静置5～8 h，挥发掉柑普茶中带有余热的水分，使柑普茶水分控制在3%～7%，得到产品（编号1001）。

1.3.2 纯生晒法

按照1.3.1小节在青皮中填充普洱熟茶进柑容器本体内，不杀青，直接阳光晒足够15 d，自然发酵，直至干透，得到产品（编号1002）。

1.3.3 低温烘培法

按1.3.1小节制得初柑普茶，再将杀青后的初柑普茶静置冷却，冷却温度为20～25 ℃（室温），时间为5～10 h，所述初柑普茶静置定型后得到中柑普茶；将定型好的中柑普茶，置入进行烘焙，烘焙温度为55 ℃，烘焙时间为5～6 h，将所述中柑普茶完全烘干后得到终柑普茶；将烘干后的终柑普茶在温度60 ℃的条件下，处理8 h，得到初产品；常温冷却（晒）：将提香后的初产品在温度20～30 ℃下静置8 h，挥发掉柑普茶中带有余热的水分，使柑普茶水分控制在3%～7%，得到产品（编号1003）。

1.4 试验方法

1.4.1 没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素的HPLC一测多评方法建立及样品含量测定

1.4.1.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～25 min，5%～50% A；25～35 min，50%～ 90% A；35～40 min，90% A；41～50 min，5% A。每针样品进样量10 μL，测定耗时50 min，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长276 nm。

1.4.1.2 精密度试验

取同一新会柑普茶混合对照品溶液，按1.4.1.1小节的色谱条件，在高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图，结果显示各特征峰的峰面积的SRSD为0.3%，表明仪器精密度良好，见表2。

表2 仪器精密度试验结果

1.4.1.3 重复性试验

取同一新会柑普茶供试品溶液（编号1001）平行6份，按1.4.1.1小节的色谱条件，在高效液相色谱仪上各进样1次，记录色谱图，结果显示各特征峰的峰面积的SRSD为0.1%～0.3%，表明方法重复性好，见表3。

表3 重复性试验结果

1.4.1.4 标准曲线绘制

精密称定没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素对照品各20 mg，分别置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容、摇匀。精密量取1，2，3，4和5 mL上述对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，即得到质量浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08和0.10 mg/mL的对照品溶液，供HPLC分析。以标准品质量浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到表4的线性回归方程。

表4 标准品回归方程及相关系数

1.4.1.5 供试品溶液的制备

将3种不同制备工艺新会小青柑普洱茶打粉，精密称取0.5 g试样（0.425 mm），置锥形瓶中，精密加入100 mL 80%甲醇溶液，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放置室温，用80%甲醇溶液补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得。

1.4.2 抗氧化活性

1.4.2.1 样品前处理

各取约2 g样品粉末，加100 mL 80%甲醇超声提取1 h，用无菌管收集，充分混匀，取适量液体样品在2～8 ℃条件下离心20 min左右（2 000～3 000 r/min），收集上清液。

1.4.2.2 DPPH法

按照DPPH试剂盒使用说明进行试验，测得测定管和对照管的吸光度，定义每分钟每毫升液体样品使反应体系的吸光度（A）每增加0.01时为一个总抗氧化能力单位，把测定管、对照管的吸光度，以及按试剂盒要求加入的反应液总量、取样量代入式（1）中，以计算总抗氧化能力（mL）。

1.5 统计分析

试验数据均用±s表示。采用SPSS 23.0软件，数据正态分布的组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐采用LSD检验；方差不齐则采用Tamhane’s T2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。并使用GraphPad Prism 9对试验数据进行整理分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析不同制备工艺新会小青柑普洱茶中有效成分

按照1.4.1小节的HPLC分析条件[1-2]，对没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素对照品及不同年份的陈皮样品进行定性定量分析，将没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素对照品用80%甲醇溶解后高效液相混标分析，结果如图1所示。由图1可知，没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素的保留时间分别为9.602，21.265，39.776和41.031 min。

图1 各对照品高效液相色谱图

在三种不同制备工艺中，柑普茶样品均能检测出没食子酸、咖啡因、川陈皮素和桔皮素，各组分具体见图2。

图2 三种不同制备工艺新会小青柑普洱茶样品高效液相色谱图

2.2 有效成分含量的差异性分析

与半生晒工艺相比，低温烘培的小青柑普洱茶中没食子酸、咖啡因、川陈皮素、桔皮素有效成分含量显著上升（P＜0.05）；与半生晒工艺相比，纯生晒的小青柑普洱茶中没食子酸、咖啡因、川陈皮素、桔皮素有效成分含量显著下降（P＜0.05）。与纯生晒工艺相比，半生晒以及低温烘培工艺的小青柑普洱茶中没食子酸、咖啡因、川陈皮素、桔皮素有效成分含量显著上升（P＜0.05）（见表5），提示低温烘培在三种工艺制备的新会小青柑普洱茶有效成分含量最高（没食子酸约为1.630±0.002 mg/g，咖啡因约为22.332±0.018 mg/g，川陈皮素约为1.263±0.000 mg/g，桔皮素约为0.978±0.001 mg/g），其次是半生晒工艺，含量最低是纯生晒工艺。

表5 三种不同制备工艺有效成分含量的比较（±s）

表5 三种不同制备工艺有效成分含量的比较（±s）

2.3 抗氧化活性分析

DPPH分析法是一种筛选自由基清除剂，评价抗氧化活性的简便方法，可用分光光度法进行定量分析，其工作原理是DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm附近有强吸收。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，DPPH的单电子被配对，在最大吸收波长处的吸光度变小，颜色变浅，且这种颜色的变浅程度与配对电子数呈剂量关系。因此，可通过在此波长处吸光度的测定来评价自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力，此抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化性越大。陈玉霞等[3-4]试验也表明吸光度越低，表明样品抑制或清除自由基能力越强。由表6可知，新会小青柑普洱茶在半生晒制备工艺下，抗氧化能力为1 282.3±20.726 1 g，优于其他两种工艺。与纯生晒工艺相比，半生晒制备工艺下抗氧化能力显著提高（P＜ 0.05）。与纯生晒工艺相比，低温烘焙制备工艺下抗氧化能力显著下降（P＜0.05）。与半生晒工艺相比，纯生晒与低温烘焙制备工艺下抗氧化能力显著下降（P＜0.05）。

表6 不同制备工艺新会小青柑普洱茶抗氧化能力结果（±s）

表6 不同制备工艺新会小青柑普洱茶抗氧化能力结果（±s）

组别 总抗氧化能力 (T-AOC) 活性DPPH法/g半生晒 1 282.3±20.73**纯生晒 1 025.4±38.38##低温烘焙 505.35±54.29**##注: *表示P＜0.05, **表示P＜0.01, 对比纯生晒; #表示P＜0.05, 对比半生晒, ##表示P＜0.01, 对比半生晒。

由此可见，新会小青柑普洱茶的三种工艺条件对比下的抗氧化能力效果为半生晒＞纯生晒＞低温烘焙，结果见图3。

图3 三种制备工艺新会小青柑普洱茶抗氧化能力图

3 讨论

3.1 不同制备工艺对新会小青柑普洱茶有效成分影响

研究表明[5-9]，类黄酮和酚酸经过热处理后，结构被破坏或释放成游离态，致使新会小青柑普洱茶中其含量减少。试验研究三种制备工艺条件的区分主要为温度以及温度处理时长。半生晒工艺是在90～98 ℃，时间为8～15 min的处理，再进行自然晾干。纯生晒工艺是在30 ℃下自然晾干。低温烘焙主要有两个阶段，第一阶段在温度为90～98 ℃，时间为8～15 min，第二阶段在温度60 ℃的条件下，处理8 h，有较长一段时间的温度处理。从研究有效成分的含量测定结果可看出，半生晒和低温烘焙制备工艺条件下制得的含量比纯生晒的含量结果高，这可能与半生晒和低温烘焙两种制备工艺均经过杀青步骤有关，提示杀青步骤可能促进对小青柑与普洱茶的发酵，但仍需要进一步研究。对于生产企业而言，纯生晒制备工艺相对于其他两种工艺简单，但晒制时间长，需要大自然的日照，不可控因素多。半生晒和低温烘焙两种制备工艺可以缩短制备新会小青柑普洱茶工艺生产时间，为实际生产节约成本，为生产新会小青柑普洱茶提供参考依据。

3.2 不同制备工艺对新会小青柑普洱茶抗氧化能力影响

有研究表明[11]，陈皮总黄酮与普洱茶总黄酮具有协同抗氧化作用，导致抗氧化效力的差异，可能是由于陈皮、普洱茶总黄酮之间的抗氧化相互作用与复配黄酮的结构和浓度有关，不同复配比影响反应体系中分子间的相互作用。由于机体中有许多抗氧化物质，能使 Fe3+还原成 Fe2+。DPPH可与菲啉类物质形成稳固的络合物，可通过比色可测出其抗氧化能力强弱。该试验通过比较新会小青柑普洱茶的三种工艺条件的抗氧化能力，其结果显示半生晒法下抗氧化能力优于纯生晒法，纯生晒法又优于低温烘焙法。根据体外抗氧化试验结果可得，半生晒条件的抗氧化能力总体较好。半生晒条件和低温烘焙条件同样都要进行进10 min的高温杀青处理。但是由于低温烘焙需要经历长时间、较高温度的烘干，可能由于高温对其抗氧化成分的活性和结构产生影响。由此可见，新会小青柑普洱茶经历短时间的高温处理对其总体抗氧化成分活性影响不大。另外，由于纯生晒工艺需要较长时间进行日照天然烘干，因此纯生晒工艺更加需要对产品进行防霉、防潮等保护措施。

3.3 进展及意义

目前新会柑普茶已经成为一种快消品，颇受消费者青睐[12-13]，但是其药理作用功效仍需进一步研究。目前已有不少对新会柑普茶高效液相色谱指纹图谱研究[14]，但是对新会小青柑柑普茶的制备工艺跟抗氧化能力之间的关系研究[15]目前较为少见。此次研究提示，新会小青柑普洱茶具有一定抗氧化功能，其具体作用机制以及对机体的药理作用仍需下一步研究。

4 结论

半生晒制备工艺的新会小青柑普洱茶有效成分含量与抗氧化能力优于低温烘焙与纯生晒、半生晒为最佳工艺，为新会小青柑普洱柑普茶的品质鉴定及制备工艺提供参考依据。广东有着丰富的柑橘资源，江门新会围绕新会柑发展出了一系列相关产业，这促进了陈皮产业的深度开发和应用。基于新会柑普茶一系列相关产业，必将会加速粤港澳大湾区农产品与食品产业转型升级，创造出更大的经济效益和社会效益，进一步推动农村与乡镇经济的健康发展，因此应重视其制备工艺及其药理作用的研究。