响应面法优化大孔树脂纯化毛木耳多糖工艺

罗淼，黄荣

成都师范学院 化学与生命科学学院，功能分子结构优化与应用四川省高校重点实验室（成都 611130）

毛木耳（Auricularia polyricha）又称黄背木耳，属于担子菌纲，木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳属（Auricularia）的毛木耳种（A.polytricha）[1]，是食药两用性食用菌，具有益气强身、活血、止血、止痛、防癌抗癌之功效[2]。毛木耳多糖属于酸性杂多糖，由五种单糖和葡萄糖醛酸组成[3]。毛木耳多糖具有提高机体免疫力、抗癌抑癌、抗凝血、降血脂、抗衰老及改善心脏功能等作用[4-5]。目前对黑木耳多糖的研究居多，毛木耳多糖较黑木耳多糖含有较多的胶质，提取难度较黑木耳更高，但毛木耳产地分布广泛，产量丰富，价格比黑木耳便宜，其子实体中多糖含量明显高于黑木耳中的含量，具有深入研究的价值。目前国内外对毛木耳的研究主要集中在栽培技术方面，而对毛木耳多糖纯化工艺还未见报道[6]。大孔树脂由于其独特的多孔结构及材料性质，多应用于黄酮[7]、多糖等[8-9]的分离纯化。研究首先采用复合酶-超声波提取毛木耳粗多糖，并进一步选用D-101、AB-8、X-5、HPD-100、MCA-9、D-141、HPD-100A这7种大孔吸附树脂对毛木耳提取物进行纯化研究，筛选出最佳的纯化树脂及最优的分离，为更有效地开发和利用毛木耳资源提供试验依据。

1 试验部分

1.1 主要仪器与材料、试剂

TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析）；PHS-3CW数字酸度计（上海殷特）；FA2204N分析天平（上海菁华公司）；202-1A电热恒温干燥箱（北京中兴公司）；KS康氏震荡器（江苏荣华仪器制造有限公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

毛木耳粉（于5—6月份采自四川什邡市涧氐镇木耳种植基地，于60 ℃烘干，粉碎过0.250 mm筛）；葡萄糖标准品（成都康邦生物科技有限公司）；D-101型大孔树脂（天津大学农药厂）；D-141、X-5大孔树脂（上海试剂一厂）；AB-8、HPD-100、MCA-9、HPD-100A型大孔树脂（南开大学化工厂）；苯酚、浓硫酸、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸均为国产分析纯。

1.2 复合酶-超声波法提取毛木耳多糖

称取一定量毛木耳粉，按适当料液比提前浸泡24 h，加复合酶[添加量为毛木耳粉质量3%（纤维素酶∶果胶酶=1∶1）]于溶液中，调节pH 4，60 ℃水浴下酶解60 min，煮沸灭酶10 min。在超声功率200 W、温度45 ℃下提取20 min，离心，在上清液中加入Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），剧烈振荡30 min，离心，取上层清液浓缩、醇沉、干燥，得毛木耳粗多糖[10-11]。

1.3 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[12]测定毛木耳多糖含量。绘制葡萄糖标准曲线Y=0.017 8X-0.017 5，R2=0.995 8，线性范围在0～32 mg/mL的范围内，质量浓度与吸光度有良好的线性关系。

式中：C为试液中的葡萄糖质量浓度，mg/mL；D为多糖的稀释因素；F为换算因子；W为毛木耳质量，g。

1.4 大孔树脂的筛选

将预处理的D-101、AB-8、X-5、HPD-100、MCA-9、D-141、HPD-100A型大孔树脂（湿树脂）[7]，各取5 g置于50 mL锥形瓶中，加入25 mL样液，于25 ℃恒温振荡3 h，静置24 h，过滤，测定滤液的多糖质量浓度，计算各种树脂的吸附率E（%）[7]。将静态吸附后的树脂用适量纯化水进行洗脱后，加入80%乙醇，振荡3 h，静置24 h，充分解吸后过滤，测定滤液的多糖质量浓度，计算各树脂解吸率B（%）[7]。

式中：C0为吸附前多糖的质量浓度，mg/mL；C1为吸附后剩余液多糖的质量浓度，mg/mL；C2为解吸液中多糖的质量浓度，mg/mL；V0为样品体积，mL；V1为吸附后剩余溶液体积，mL；V2为解吸体积，mL。

1.5 D-101静态吸附的动力学曲线

取5 g预处理好的D-101型大孔树脂，放入50 mL锥形瓶中，加入25 mL质量浓度为4.0 mg/mL的毛木耳粗多糖溶液，将锥形瓶于摇床振荡4 h，每0.5 h取2 mL溶液，用1.3小节的方法测定多糖含量，计算吸附率，绘制吸附曲线。

1.6 D-101大孔树脂纯化工艺单因素试验

1.6.1 上样液质量浓度对吸附率的影响

取7份预处理好的D-101型大孔树脂，每份5 g（湿树脂），装于10 mm×200 mm的层析柱中，加入质量浓度为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mg/mL的粗多糖溶液，调节pH 4，以2.0 mL/min的速度上样并静置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小节的方法测定多糖含量，计算大孔树脂吸附率。

1.6.2 上样液pH对吸附率的影响

取6份预处理好的D-101型大孔树脂，每份5 g（湿树脂），装于10 mm×200 mm的层析柱中，按1.6.1小节确定最佳质量浓度条件，用稀盐酸调节质量浓度为4.0 mg/mL的粗多糖溶液pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，以2.0 mL/min的速度上样并静置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小节的方法测定多糖含量，计算大孔树脂吸附率。

1.6.3 上样液速度对吸附率的影响

取6份预处理好的D-101型大孔树脂，每份5 g（湿树脂），装于10 mm×200 mm的层析柱中，按以上确定的最佳条件，取质量浓度4.0 mg/mL，pH 4的粗多糖溶液，分别以1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL/min的速度上样并静置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小节的方法测定多糖含量，计算大孔树脂吸附率。

1.6.4 洗脱剂质量分数对解吸率的影响

取7份预处理好的D-101型的大孔吸附树脂，每份5 g（湿树脂）分别装于10 mm×200 mm的层析柱中，按上述步骤确定的最佳上样条件进行上柱，以相同速率用适量纯化水进行洗脱后，各层析柱分别用10%，30%，50%，70%，80%，90%和95%乙醇进行洗脱，洗脱速度2.0 mg/min，收集洗脱液，按1.3小节的方法测定含量，计算大孔树脂解吸率。

1.6.5 洗脱速率对解吸率的影响

取5份预处理好的D-101型的大孔吸附树脂，每份5 g（湿树脂）分别装于10 mm×200 mm的层析柱中，按上述步骤确定的最佳上样条件进行上柱，以相同速率用适量纯化水进行洗脱后，各层析柱用80%的乙醇进行洗脱，洗脱速率为0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/min，收集洗脱液，按1.3小节的方法测定多糖含量，计算大孔树脂解吸率。

1.6.6 洗脱剂用量对解吸率的影响

取5份预处理好的D-101型的大孔吸附树脂，每份5 g（湿树脂）分别装于10 mm×200 mm的层析柱中，按上述步骤确定的最佳上样条件进行上柱，以相同速率用适量纯化水进行洗脱后，各层析柱用2，3，4，5和6 BV的80%的乙醇进行洗脱，洗脱速率为2.0 mL/min，收集洗脱液，按1.3小节的方法测定多糖含量，计算大孔树脂解吸率。

1.7 响应面试验因素和水平

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的试验设计原理，以上样液pH（A）、上样液质量浓度（B）和上样液速度（C）为响应值，设计响应面试验。试验因素与水平值见表1。

表1 响应曲面分析试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的选取

从表2可以看出，D-101型树脂在吸附率以及解吸率上都较高，表现出良好的吸附和解吸性能。因此，最终选择D-101型大孔树脂作为接下来试验的树脂。

表2 七种大孔树脂的静态吸附与解吸结果

2.2 D-101静态吸附的动力学曲线

如图1所示，D-101型大孔树脂对多糖的吸附在前2 h呈上升趋势，在2 h后吸附率呈稳定趋势，逐渐平稳。

图1 静态吸附的动力学曲线

2.3 吸附工艺研究

2.3.1 单因素试验结果

2.3.1.1 上样液质量浓度对吸附率的影响

如图2所示，当上样液质量浓度小于4 mg/mL时，大孔树脂对多糖的吸附率呈增长趋势，当质量浓度过大时，明显可以看出吸附率不再上升，反而下降。因此，选取4 mg/mL为上样液最佳质量浓度。

图2 上样液质量浓度对吸附率的影响

2.3.1.2 上样液pH对吸附率的影响

pH对多糖的存在影响很大，因而也会影响到吸附率。如图3可知，选取pH 4上样，吸附率达到最佳。

图3 上样液pH对吸附率的影响

2.3.1.3 上样液速度对吸附率的影响

由图4可知，总体来看，上样液速度在吸附过程中的影响不是很大，因此，选择2.5 mL/min作为上样液速度，既可保证吸附的程度又节约了时间。

图4 上样液速度对吸附率的影响

2.3.2 响应曲面试验

综合单因素试验影响结果，以对毛木耳多糖吸附率影响显著的三个因素（上样液pH、上样液质量浓度、上样液速度）为自变量，采用Design Expert软件对试验数据进行三因素三水平响应面试验。响应面分析方案与结果见表3。

表3 响应面分析试验方案及试验结果

运用Design Expert软件分析，以上样液pH、上样液质量浓度、上样液速度为响应变量，多糖吸附率为响应值，进行回归拟合分析，可得到模型：Y=78.70+ 0.90A+1.70B+1.14C-0.48AB+0.18AC-0.51BC-2.26A2-1.11B2-1.58C2。

其中，对回归方程进行方差分析及显著性检验，结果见表4。方程中的B、A2影响极其显著，C、C2的影响显著。该模型的R=0.954 4，R值越接近于1，拟合度越高，自变量和响应值之间线性关系越显著。表4中，FA=5.52，FB=19.52，FC=8.90，所以各因素对吸附率的影响程度大小为上样液质量浓度＞上样液速度＞上样液pH。

表4 吸附率回归方程的方差分析结果

响应面优化D-101大孔树脂对毛木耳多糖吸附率的最佳方案为上样液质量浓度4.68 mg/mL，上样液pH 4.14，上样液速度2.63 mL/min，此条件下理论吸附率为79.48%。

采用交互作用组图即可对两两因素交互影响毛木耳多糖吸附率的效应进行分析和评价，如图5所示。各个响应曲面的开口均为向下的凸面，表示该模型在试验范围内存在稳定点，且稳定点为最大值。各个等高线呈圆形，两因素的交互作用不明显。综合分析可得上样液质量浓度对吸附率的数值影响最大。

图5 两因素交互作用对吸附率影响的响应面及等高线图

2.4 洗脱工艺研究

2.4.1 洗脱剂体积分数对解吸率的影响

不同体积分数乙醇对解吸率有所影响，当乙醇体积分数增加时，解吸率升高，由图6可知，95%的乙醇和80%的乙醇洗脱能力相差不大，综合考虑，选择80%的乙醇为最佳洗脱体积分数，既节约成本，同时也具有良好的洗脱效果。

图6 洗脱剂体积分数对解吸率的影响

2.4.2 洗脱速率对解吸率的影响

由图7可知，当洗脱速率增大时，解吸率会减小，但洗脱速率过小，需花费时间过久，综合考虑，选择2.0 mL/min为最佳洗脱速率。

图7 洗脱速率对解吸率的影响

2.4.3 洗脱剂用量对解吸率的影响

由图8可知，当洗脱液用量超过4 BV时，解吸率不会出现大幅度增加趋势，故选择4 BV 80%乙醇溶液为最佳洗脱剂用量。

图8 洗脱剂用量对解吸率的影响

2.5 最佳条件的纯化结果

取3份预处理好的D-101型的大孔树脂，每份5 g（湿树脂）分别装于10 mm×200 mm的层析柱中，毛木耳多糖溶液5 mg/mL，pH 4，以2.5 mL/min的速率上柱，以相同速率用适量纯化水洗脱，再用4 BV的80%乙醇溶液以2.0 mL/min的速率洗脱，收集洗脱液，按1.3小节的方法测定。纯化前多糖含量为8.31%，纯化后为23.59%，表明纯化效果较好。

3 结论

研究探讨大孔树脂纯化毛木耳多糖的最佳工艺条件，通过比较7种大孔树脂的静态吸附-洗脱效果，并结合树脂的静态吸附动力学，确定采用型D-101大孔树脂纯化提取粗多糖。结合单因素试验和响应曲面试验，以多糖吸附率为检测指标，优化出D-101型大孔树脂吸附多糖最佳工艺条件：上样液质量浓度4.68 mg/mL，上样液pH 4.14，上样液速度2.63 mL/min，理论吸附率为79.48%。再通过对洗脱工艺进行单因素试验，得出D-101型大孔树脂解吸条件：4 BV 80%乙醇溶液，2.0 mL/min的洗脱速率进行解吸，其解吸率为81.75%。在最佳纯化工艺条件下多糖含量由8.31%增加到 23.59%，毛木耳多糖的纯化率较好，结果稳定可靠。