破壁油菜花粉的抗氧化及抗衰老作用

方欢乐，张 洁，赵玉文，韩宁娟，王卫东，李 元,

（1.西安培华学院医学院，陕西西安 710125；2.陕西康泰莱生物医药工程有限公司，陕西西安 710065）

油菜花粉是人们公认的天然健康食品，其中富含酚类、黄酮类、脂肪酸、维生素和无机元素等物质[1]，具有抗疲劳、降血脂、抑制前列腺增生、促进神经系统功能等多种作用[2]。油菜花粉其中含有的丰富黄酮类物质具有很好的清除机体自由基（·OH、O2-·、DPPH·等）作用[3-4]。研究发现，破壁技术可以使蜂花粉内丰富营养成分充分释放，其中抗氧化成分总黄酮及黄酮类化合物的生物利用度明显提升[5-6]。

衰老是生命体发展的必然选择趋势，其受多种因素调控，目前关于衰老的理论主要有自由基氧化应激学说、DNA 损伤学说、细胞凋亡学说等[7]。多项研究表明，Sirt1（沉默信息调节因子2 相关酶1）可抑制细胞凋亡，激活负调节促凋亡因子如p53 来增加氧化应激的对抗性调控新陈代谢，延缓细胞的衰老。因此Sirt1 在抗衰老方面的重要作用引起人们关注[8]。Bax 蛋白是一种促进细胞凋亡的蛋白，其蛋白表达也能一定程度反应组织的衰老情况[9]。

目前关于破壁油菜花粉的研究主要是探讨破壁技术的方法及其对主要成分的影响，王伟等[10-11]研究破壁油菜花粉在体抗氧化作用表明其具有良好的在体抗氧化活性。但破壁油菜花粉是否可以通过抗氧化改善衰老作用，目前未见报道。本研究建立D-半乳糖衰老模型[12]观察破壁油菜花对机体血清及肝脏匀浆液中抗氧化指标SOD、MDA、GSH-Px、CAT的变化，同时研究破壁油菜花是否具有通过抗氧化作用抑制肝脏中Bax 蛋白表达，调节Sirt1 蛋白含量对抗p53 途径的凋亡通路，从而延缓组织衰老。本研究可为破壁油菜花粉保健产品的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SD 小鼠48 只 雄性，体重（25±2） g，清洁级，购买于西安交通大学医学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（陕）2012-003；破壁油菜花粉 陕西康泰莱生物医药工程有限公司；VC注射液 华润双鹤利民药业（济南）有限公司；D-半乳糖粉剂 上海国药集团；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；多克隆第一抗体Sirt1、p53、bax 及GAPDH 抗体 由Abcam 公司提供。

H-1600A 型高速离心机 上海利鑫坚离心机有限公司；超声波组织粉碎仪 南京先欧仪器制造有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅 常州中捷实验仪器制造有限公司；1510 酶标仪 Thermo 公司；PowerPactmBasic 电泳设备、Universal Hood III 发光设备 美国Bio-Red 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 破壁油菜花粉混悬液的制备 分别称取相应质量的破壁油菜花粉，加超纯水混悬制备为所需浓度。置于试剂瓶中，4 ℃冷藏保存待用。

1.2.2 动物分组、造模及给药处理 SD 小鼠随机分为6 组，每组8 只，分别为空白对照组、衰老模型组、破壁油菜花粉低剂量组（140 mg/kg）、中剂量组（280 mg/kg）、高剂量组（560 mg/kg）和VC组（100 mg/kg）。动物研究获西安培华学院动物保护与使用委员会批准。所有动物实验均按照实验动物机构指南进行。药物给药剂量根据临床常用剂量，按照人和动物间体表面积折算的等效剂量比值进行换算[13]，并结合文献资料报道的破壁油菜花粉抗氧化小鼠给药剂量设计[10]。动物适应性饲养一周后，除空白对照组外的各组每日腹腔注射D-半乳糖（120 mg/kg）造模，空白对照组每日腹腔注射生理盐水，同时破壁油菜花粉各组和VC组分别灌胃不同剂量破壁油菜花粉混悬液及VC溶液，空白对照组及衰老模型组灌胃等容积生理盐水。连续给药六周。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 小鼠行为活动观察和体重检测 在实验期间，每天观察和记录各组小鼠的食欲、外表、精神状况和行为活动。每周称重1次，绘制小鼠体重变化曲线图。

1.2.3.2 脏器指数测定 采血后立即脱颈椎处死小鼠，置于冰块上取出胸腺、肝脏、肾和脾脏。用4 ℃生理盐水多次冲洗，滤纸吸干水分，称重，计算脏器指数。脏器指数（mg/g）=脏器质量（mg）/体质量（g）。

1.2.3.3 血清及肝脏生化指标检测 末次给药禁食不禁水12 h 后，眼球取血，3500 r/min 离心20 min后，分离血清。取小鼠部分肝脏加冰浴过的生理盐水制备10%的肝组织匀浆2 mL，12000 r/min 低温离心10 min，分离上清液。采用试剂盒测定小鼠血清及肝脏匀浆液中SOD、MDA、GSH-Px、CAT 含量。

1.2.3.4 肝脏组织切片观察 取小鼠部分肝脏组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，HE 染色。生物显微镜下观察、拍照。

1.2.3.5 Western Blot 检测肝脏组织中衰老蛋白表达取-80 ℃保存的肝脏组织，裂解，12000 r/min，4 ℃离心10 min。取上清液蛋白定量，剩余与5× loading buffer 混合，恒温金属浴100 ℃变性10 min 后保存备用。用8% SDS-多聚酰胺凝胶电泳分离，湿法转移蛋白到PVDF 膜上。膜用5%脱脂牛奶溶液室温封闭1 h，分别加入特异性一抗bax（1:500）、Sirt1（1:500）、p53（1:500）、GAPDH（1:2000）孵育，4 ℃过夜。用TBST 洗膜5次后与二抗结合（抗鼠或抗兔1:5000）室温孵育1 h 后，TBST 洗膜5次。发光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software 分析。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0 统计软件，计量资料结果以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）双侧t检验。P＜0.05 为差异有显著性，P＜0.01 为差异具有极显著性。

2 结果与分析

2.1 破壁油菜花粉对D-半乳糖衰老小鼠体重的影响

体重是反映小鼠的生长情况的一个重要指标。由表1所示，衰老模型组小鼠随着造模后体质量增加缓慢，食欲差、皮肤松弛、活动量明显减少等现象，提示衰老模型组小鼠出现衰老症状。破壁油菜花粉各组小鼠体重不断增加，小鼠皮肤状态及活动量有所改善。进一步从表1 数据分析得出，和衰老模型组比较，破壁油菜花中、高剂量组给药14 d 后小鼠体重均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），低剂量组在32 d 后体重也在增加（P＜0.05）。表明破壁油菜花粉可改善小鼠体重及活动对抗衰老。

表1 破壁油菜花粉对衰老小鼠体质量的影响（g, n=8）Table 1 Effect of wall broken rape pollen on body mass of aging mice (g, n=8)

2.2 破壁油菜花粉对D-半乳糖衰老小鼠脏器指数的影响

脏器系数的变化可反映器官或组织结构的变化，由表2可知，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、胸腺的脏器指数呈极显著下降趋势（P＜0.05，P＜0.01），表明衰老小鼠的肝、肾及免疫器官功能出现萎缩。与衰老模型组相比，破壁油菜花粉中、高剂量组小鼠的肝脏、脾脏、胸腺、肾脏的脏器指数均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。从数据结果可看出破壁油菜花粉对D-半乳糖诱发的小鼠脏器衰老有一定的改善作用。

表2 破壁油菜花粉对衰老小鼠脏器指数的影响（mg/g, n=8）Table 2 Effect of wall broken rape pollen on organ index of aging mice (mg/g, n=8)

2.3 破壁油菜花粉对D-半乳糖衰老小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px 及CAT 活性的影响

大量研究表明，自由基及其诱导的氧化反应可导致机体的衰老[14]。实验结果表明与空白对照组相比，衰老模型组小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px 含量极显著降低（P＜0.01），MDA 含量极显著升高（P＜0.01）。与衰老模型组相比，中、高剂量破壁油菜花粉组SOD、GSH-Px 含量极显著升高（P＜0.01），MDA 含量极显著减小（P＜0.01），CAT 含量中剂量组显著升高（P＜0.05）、高剂量组极显著升高（P＜0.01），结果见表3。

2.4 破壁油菜花粉对D-半乳糖衰老小鼠肝脏中SOD、MDA、GSH-Px 及CAT 活性的影响

由表4 可以看出，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠的肝脏中SOD、CAT、GSH-Px 活性极显著降低，MDA 含量极显著增加（P＜0.01）。与衰老模型组相比，破壁油菜花粉中、高剂量组可显著提高小鼠肝脏中SOD、CAT、GSH-Px 含量，降低MDA 含量（P＜0.05，P＜0.01）。有研究表明机体正常情况下处于一种氧化与抗氧化的动态平衡当中，衰老机体产生大量自由基诱导脂质过氧化产物MDA 的生成，而同时机体中重要的抗氧化酶含量下降，因此清除自由基抑制机体氧化反应可改善衰老[15]。表3～表4 结果显示衰老模型组小鼠体内MDA 含量增加，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 含量极显著下降（P＜0.01）。破壁油菜花粉能明显抑制血清及肝脏中MDA 含量，增加SOD、CAT、GSH-Px 含量，表现出较好的抗氧化、保护肝脏、抗衰老的作用。

表3 破壁油菜花粉对衰老小鼠血清SOD、MDA、GSH-Px、CAT 活性的影响（n=8）Table 3 Results of wall broken rape pollen on serum SOD, MDA, GSH-Px and CAT activities of aging mice (n=8)

表4 破壁油菜花粉对衰老小鼠肝脏SOD、MDA、GSH-Px、CAT 活性检测结果（n=8）Table 4 Detection results of SOD, MDA, GSH-Px and CAT activities of wall broken rape pollen on liver of aging mice (n=8)

2.5 破壁油菜花粉对D-半乳糖衰老小鼠肝脏的影响

随着衰老的发生，肝脏老化质量明显减少，肝脏功能及其结构也会发生变化[16]。本研究进一步通过HE 染色观察肝脏结构的变化，结果发现空白对照组小鼠肝脏细胞排列紧密，胞核清晰；衰老模型组小鼠肝脏细胞疏松肿胀，排列紊乱，胞质受损。药物组有所改善，其中破壁油菜花粉中、高剂量组小鼠肝细胞细胞形态逐渐趋于正常，细胞损伤情况得到有效缓解。表明破壁油菜花粉对衰老的肝脏具有一定的保护作用。结果见图1所示。

图1 各组小鼠肝脏光镜下病理形态学改变（HE 200×）Fig.1 Pathomorphological changes of liver of mice in each group under light microscope （HE 200×）

2.6 破壁油菜花粉对D-半乳糖衰老小鼠肝脏Sirt1、Bax、p53 蛋白表达的影响

研究显示Sirt1 的激活对衰老调节因子p53 有明显的抑制作用，从而减少细胞凋亡，延缓衰老[17]。本研究结果如图2所示，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠的肝脏中Sirt1 蛋白量极显著降低（P＜0.01），Bax、p53 蛋白表达量极显著增加（P＜0.01），与衰老模型组相比，破壁油菜花中、高剂量组能显著地提高肝组织Sirt1 蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），降低Bax、p53 蛋白表达（P＜0.01）。这表明破壁油菜花粉可通过调控衰老蛋白Sirt1、p53 含量，抑制促细胞凋亡基因Bax表达量的增多，对抗机体衰老。

图2 破壁油菜花对衰老模型小鼠肝脏Bax、Sirt1、p53 蛋白表达的影响（n=3）Fig.2 Effect of wall broken rape flower on the expression of Bax, Sirt1 and p53 proteins in liver of aging model mice (n=3)

3 讨论

衰老是随着机体年龄的增长，脏器萎缩、机体功能衰退的生命过程中一种自然现象[18]。体内SOD、GSH-Px、CAT 抗氧化酶，有很好的抗氧化，对抗机体 自由基破坏的作用。而随着衰老的发生，机体氧化还原系统变得不平衡，清除自由基的SOD、CAT、GSHPx 等内源性抗氧化酶活性降低而脂质氧化产物MDA 含量增多，引发细胞损伤、组织器官紊乱[19-20]。研究衰老最普遍的模型为给正常小鼠注射大剂量的D-半乳糖，引起机体氧化反应产生大量氧自由基等出现衰老症状，同时其还可在机体酶的作用下转化为半乳糖醇堆积，导致机体功能障碍及衰老[21]。

油菜花粉是油菜精华的浓缩，营养成分丰富，具有抗氧化、免疫调节等功效，通过破壁技术可使其营养成分充分释放[22]。本实验结果显示衰老模型组小鼠的体质量明显下降，重要脏器胸腺、脾、肝脏、肾脏的脏器指数均下降，出现机体衰老症状。而破壁油菜花粉中、高剂量组小鼠体质量明显改善，各脏器的脏器指数均增大，表明破壁油菜花粉可保护脏器对D-半乳糖所致的衰老现象有一定的延缓发展作用。由于衰老小鼠体内自由基防御系统损伤[23]，本实验进一步测定了血清中CAT、GSH-Px、MDA、SOD 含量来研究机体的衰老状况。结果显示衰老模型组MDA 含量增多，SOD、CAT、GSH-Px 含量降低，其体内氧化与抗氧化动态平衡被打破。破壁油菜花粉中、高剂量组SOD、CAT、GSH-Px 含量明显增加，MDA 含量降低。表明破壁油菜花粉可以改善D-半乳糖所致氧化应激反应。

肝脏是物质代谢的主要器官，也是个体衰老中最易受累的器官[24]。本研究进一步观察了小鼠肝脏的变化发现伴随衰老，模型组出现肝脏脏器指数的下降同时肝脏中SOD、CAT、GSH-Px 降低，MDA 含量增加，肝脏细胞之间出现萎缩、损伤等情况，但是破壁油菜花中、高剂量组得到很大改善，肝脏指数增加，肝脏中抗氧化酶含量提高，肝细胞趋于正常。表明其可以改善肝脏的功能，提高机体抵抗力，抗氧化对抗衰老。

研究显示机体发生自由基氧化应激反应导致衰老同时伴随着细胞凋亡速度加快，多种衰老组织中均发现细胞凋亡蛋白Bax 的表达异常，引发细胞增殖减慢[25]。大量研究显示Sirt1与p53基因可通过改善细胞凋亡参与衰老过程的调节[26]，Sirt1可通过抑制细胞凋亡，延缓细胞衰老，在衰老研究的发展起到了重要作用。p53 是最早发现的Sirt1 生理产物，是抑癌基因也参与细胞衰老过程[27]。本研究进一步观察了衰老小鼠肝脏内衰老基因表达，结果衰老基因Sirt1 蛋白表达显著降低，p53 蛋白表达升高，同时伴随凋亡蛋白Bax 增多。破壁油菜花粉中、高剂量可以调节衰老基因蛋白表达，改善细胞凋亡，对抗机体衰老。

4 结论

本文研究了破壁油菜花粉对D-半乳糖诱导的衰老小鼠抗氧化，改善衰老的作用机制。结果显示破壁油菜花粉可以调节体内血清及肝脏中氧化酶的活性，表现出很好的抗氧化作用，可对抗衰老小鼠体重减轻、脏器损伤，保护肝脏。同时研究发现破壁油菜花粉抗衰老的作用机理可能与激活肝脏Sirt1/p53 信号通路，抑制肝脏Bax 细胞凋亡有关。此研究可为破壁油菜花粉研制成抗氧化、抗衰老功效的保健品，用于预防疾病等研究提供理论依据。但破壁油菜花粉抗衰老保健品人体长期服用的安全性与保健功效还有待于进一步深入研究，下一步可开展破壁油菜花粉保健品长期服用的安全性试验研究。总之，破壁油菜花粉的开发对防治衰老疾病，提高人们生活质量水平有重要意义。