超声辅助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖的工艺优化

史继童，孙 羽，姜欣洋，刘兰玲，颜培正，李 佳，蒲高斌，赵东升

（山东中医药大学药学院，山东济南 250355）

大蒜（Allium sativumL.）为葱科或广义百合科葱属草本植物[1]，地下鳞茎为药食两用资源，性温，味辛，富含大蒜辣素、多糖、蒜氨酸等多种活性成分[2-3]，大蒜辣素是大蒜中最主要的活性成分，多糖含量最大，约占鲜蒜质量的26%～30%，二者具有高效的抗菌、抗癌、抗氧化和免疫调节活性等药理作用[4-6]。

目前国内外研究多集中对大蒜中大蒜辣素或多糖的单一成分提取[7-9]，而鲜有同步提取两种活性成分的工艺研究。若能对大蒜中大蒜辣素和多糖进行同步提取，不仅可以提高大蒜资源的利用率，且降低成本，将产生良好的经济效益。三相分配体系（threephase partitioning，TPP）是一种简易的新型分离技术，可以将从动植物中提取的组分分配在三相中实现选择性分离，即上相（油脂及脂溶性物）、中相（蛋白质）和下相（多糖类等水溶性物质）[10]，已有学者利用三相分配体系提取多糖、蛋白质、油脂等天然活性成分[11-14]。大部分TPP 体系由叔丁醇、硫酸铵和粗水提取液（或悬浮液）组成。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）为水溶性非离子聚合物，与叔丁醇相比具有无毒性、生物相容性等优点[15]，已被广泛应用于新型TPP 体系中，并有研究报道称聚乙二醇可以大大提高大蒜中蒜酶催化反应中的稳定性[16]。

因此，本研究以聚乙二醇为有机相，硫酸铵为水相，采用超声辅助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖，通过单因实验和响应面法优化提取工艺，并对上相大蒜辣素提取液的稳定性进行考察，为大蒜资源的进一步研究开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蒜 山东省济南市长清区当地超市，置4 ℃冰箱保存备用；L-半胱氨酸（纯度大于99%）、5,5′-二硫代双（DTNB，纯度大于98%）、浓硫酸（纯度大于98%）、聚乙二醇4000、硫酸铵、Hepes、苯酚 上海麦克林生化科技有限公司。

KQ-500GVDV 双频恒温数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；ST 16R 高速离心机 赛默飞世尔科技有限公司；UV 9100 B 紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大蒜辣素和多糖的同步提取

1.2.1.1 样品预处理 参考关明等报道方法[17]，取适量新鲜大蒜，去皮，用蒸馏水洗净，晾干鳞茎，用组织捣碎机捣碎成蒜浆，置40 ℃水浴10 min。

1.2.1.2 三相分配法提取大蒜辣素和多糖 参照Yan 等[11]报道并稍做修改。将聚乙二醇和硫酸铵按一定质量比例置于离心管中，加入蒜浆5.0 g，固定体系质量为25 g，剩余质量用蒸馏水补足。在一定条件超声提取，过滤，6000 r/min 离心10 min，得到TTP 体系。分别取上、下相提取液以蒸馏水稀释并定容至25 mL 容量瓶，用于测定大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2 单因素实验 为了确定超声辅助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖的工艺优化参数范围，在前期预试验和文献报道[18]的基础上，固定超声频率45 kHz 和功率350 W，选取PEG 质量分数、硫酸铵质量分数、超声温度、超声时间为主要工艺参数进行研究。

1.2.2.1 不同硫酸铵质量分数对大蒜辣素和多糖提取量的影响 称取5.0 g 蒜浆5 份，设置硫酸铵质量分数分别为12%、15%、18%、21%、24%，在PEG质量分数为24%、超声时间为40 min、超声温度为30 ℃条件下提取，试验重复3次，取平均值计算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.2 不同PEG 质量分数对大蒜辣素和多糖提取量的影响 称取5.0 g 蒜浆5 份，设置PEG 质量分数分别为14%、19%、24%、29%、31%，在硫酸铵质量分数为18%、超声时间为40 min、超声温度为30 ℃条件下提取，试验重复3次，取平均值计算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.3 不同超声温度对大蒜辣素和多糖提取量的影响 称取5.0 g 蒜浆5 份，设置超声温度分别为10、30、50、70、80 ℃，在PEG 质量分数为24%，硫酸铵质量分数为18%，超声时间为40 min 条件下提取，试验重复3次，取平均值计算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.4 不同超声时间对大蒜辣素和多糖提取量的影响 称取5.0 g 蒜浆5 份，设置超声时间为10、40、70、100、130 min，在PEG 质量分数为24%，硫酸铵质量分数为18%、超声温度为30 ℃条件下提取，试验重复3次，取平均值计算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.3 响应面试验 基于单因素实验结果，选择对大蒜辣素和多糖提取量影响显著的三个因素为Box-Behnken 试验的自变量，以大蒜辣素和多糖提取量为响应值，优化提取工艺。因素水平设计见表1。

表1 响应面因素水平设计Table 1 Response surface factor level design

1.2.4 大蒜辣素提取液稳定性的考察 由于大蒜辣素化学性质不稳定，遇光、热分解成各种含硫化合物[19]，因此在Design-Expert 8.0.6 软件优化的最佳工艺条件下，考察大蒜辣素提取液在室温放置0、2、4、6、8、10 h 后，大蒜辣素提取液的稳定性。

1.2.5 大蒜辣素和多糖提取量的测定 由于生长环境、气候等因素导致不同产地和采收期大蒜含水量差异较大，本研究以干燥品计算大蒜辣素和多糖的提取量[20]。

1.2.5.1 大蒜辣素提取量的测定 取5.0 mL Hepes缓冲液（pH7.5）配制的10 mmol/L 半胱氨酸溶液，加入1.0 mL 上相提取液，混合均匀，26 ℃水浴静置15 min，取1.0 mL 稀释100 倍；取4.5 mL 稀释后的反应混合液与0.5 mL 用Hepes 缓冲液（pH7.5）配制浓度为1.5 mmol/L 的 DTNB 溶液，混合均匀，26 ℃水浴静置15 min，在412 nm 波长下测量吸光度值（A）[21]。按上述操作步骤加1.0 mL 去离子水测量半胱氨酸溶液未与上相提取液反应的初始吸光度值（A0）。

其计算公式如下：

式中：c 为大蒜辣素物质的量浓度（mmol/mL）；A0为半胱氨酸溶液的初始吸光度值；A 为半胱氨酸溶液与上相提取液反应后的吸光度值；β为半胱氨酸溶液的稀释倍数；14150 为摩尔消光系数。

式中：Y1为大蒜辣素提取量（mg/g）；V 为上相提取液总体积（mL）；M 为大蒜辣素的分子量；m 为蒜浆的质量（g）。

1.2.5.2 多糖提取量的测定 多糖的提取量用苯酚-硫酸法测定[22]。以葡萄糖的浓度C（g/L）和吸光度A 为X、Y 轴，标准曲线方程为A=89.235C+0.0771（r=0.9989）。根据标准曲线方程计算多糖在下相中的提取量。

式中：Y2为多糖提取量（mg/g）；C 为按照标准曲线方程计算得到的多糖质量浓度（g/L）；V 为下相提取液总体积（mL）；N 为下相提取液稀释倍数；m 为蒜浆的质量（g）；103为单位转换。

1.3 数据处理

所有实验操作重复3次，实验数据为3次平行测定的平均值。使用软件Excel、SPSS 26.0、Design-Expert 8.0.6 分析数据，GraphPad Prism 8 绘图。在单因素方差分析（ANOVA）之后，进行事后Turkey HSD 检验，方差分析中P＜0.05 表明具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 硫酸铵质量分数对大蒜辣素提取量和多糖提取量的影响 由图1可知，在固定相同提取条件下，随着硫酸铵质量分数的增大，上相中大蒜辣素的提取量先呈现先下降后上升的趋势，这与前期报道现象一致[23]，可能由于体系中硫酸铵的质量分数增加时，会与PEG 争夺体系中的水分子，使大蒜辣素在上相的含量减少，导致提取量下降。当硫酸铵质量分数超过18%后，提取量显著下降（P＜0.05）。下相中多糖的提取量呈现先上升后下降的趋势，由于硫酸铵质量分数的增加，盐溶效应不断增强，下相水合能力增强从而吸水能力增强，加强了多糖在下相的析出作用[24]，当硫酸铵质量分数过高时，影响多糖结构表面的疏水性，改变了上下两相体积比和分配系数，从而使得提取量降低[25]。由于硫酸铵质量分数为15%～21%时多糖提取量变化不显著（P＞0.05），综合考虑，选择硫酸铵质量分数为18%作为后续提取条件。

图1 硫酸铵质量分数对大蒜辣素和多糖提取量的影响Fig.1 Effects of ammonium sulfate concentration on extraction efficiency of allicin and polysaccharides

2.1.2 不同PEG 质量分数对大蒜辣素和多糖提取量的影响 由图2可知，在固定相同提取条件下，随着PEG 质量分数的增大，上相中大蒜辣素的提取量呈现先上升后下降的趋势，且在PEG 质量分数为24%时达到最大，且与其它PEG 质量分数存在显著性差异（P＜0.05）。下相中多糖的提取量呈下降的趋势。由于PEG 质量分数的不断增加，TPP 体系的黏度增加，成相物质分子之间空间位阻增大[26]，导致大蒜辣素和多糖在TPP 体系中分配减少，TTP 体系溶液黏度的增加不利于蒜浆的过滤分离，更不便于工业化生产。综合考虑，选择PEG 质量分数为24%作为后续提取条件。

图2 PEG 质量分数对大蒜辣素和多糖提取量的影响Fig.2 Effects of PEG concentration on extraction efficiency of allicin and garlic polysaccharides

2.1.3 超声温度对大蒜辣素和多糖提取量的影响由图3可知，在固定相同提取条件下，随着超声温度的增大，上相、下相中大蒜辣素、多糖的提取量均呈现先上升后下降的趋势。大蒜辣素和多糖的提取量分别在30 和70 ℃时达到最大。由于大蒜辣素在高温下不稳定，易分解，提取温度在30 ℃之后，上相中大蒜辣素提取量显著降低（P＜0.05）。同时随着体系温度过高，硫酸铵的水解程度越大，不利于大蒜辣素和多糖的提取。综合考虑，选择超声温度30 ℃作为后续提取条件。

图3 超声温度对大蒜辣素和多糖提取量的影响Fig.3 Effects of sonication temperatures on extraction efficiency of allicin and polysaccharides

2.1.4 超声时间对大蒜辣素和多糖提取量的影响由图4可知，在固定相同提取条件下，随着超声时间的增大，上相、下相中大蒜辣素、多糖的提取量均呈现先上升后下降的趋势。大蒜辣素和多糖的提取量分别在40 和70 min 时达到最大。随着超声时间的增加，大蒜辣素由于发生分解，而多糖由于长时间处理破坏结构导致提取量显著降低（P＜0.05）[27]。综合考虑，选择超声时间为40 min 作为后续提取条件。

图4 超声时间对大蒜辣素和多糖提取量的影响Fig.4 Effects of sonication times on extraction efficiency of allicin and garlic polysaccharides

2.2 响应面试验结果

2.2.1 回归模型建立与方差分析 选用超声时间（A）、超声温度（B）、聚乙二醇质量分数（C）为自变量，大蒜辣素提取量（Y1）和多糖提取量（Y2）为响应值，进行三因素三水平的实验设计（表2）。运用Design-Expert 8.0.6 软件进行拟合分析，结果见表3、表4。

表2 响应面分析设计及结果Table 2 Design and results of response surface analysis

由表3可知：回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明回归方程模拟可靠，不存在失拟因素。大蒜辣素提取量与各因素的拟合方程为：Y1（大蒜辣素提取量）=3.55+0.25A+0.019B-0.018C-0.31AB-0.30AC+0.36BC-0.69A2-0.64B2-0.96C2。R2=0.9897，说明该模型拟合度较好，数学模型稳定，可以对不同提取条件下大蒜辣素提取量结果进行预测。对各因素的P值和F值进行综合分析，A、AB、AC、BC、A2、B2和C2对大蒜辣素提取量的影响极具显著性。影响主次因素为超声时间（A）＞超声温度（B）＞聚乙二醇质量分数（C）。各交互因素中对大蒜辣素提取量影响程度最大的为BC，影响程度最小的为AC。

表3 大蒜辣素提取量回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for allicin extraction

由表4可知：回归模型显著（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05），表明回归方程模拟可靠，不存在失拟因素。多糖提取量与各因素的拟合方程为：Y2（多糖提取量）=40.20+4.66A+2.39B-0.53C+2.64AB-0.26AC-0.17BC-4.16A2-1.11B2-0.87C2。R2= 0.8653，说明该模型拟合度良好，数学模型稳定，可以对不同提取条件下多糖提取量结果进行预测。对各因素的P值和F值进行综合分析，A 和A2对多糖提取量的影响极具显著性，B 的影响显著。而各因素交互作用AB、AC、BC 的影响均不具有显著性（P＞0.05）。影响主次因素为超声时间（A）＞超声温度（B）＞聚乙二醇质量分数（C）。

表4 多糖提取量回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for polysaccharide extraction

2.2.2 响应曲面图分析 根据多元回归方程获得不同处理因素影响大蒜辣素提取量的等高线图（图5）。等高线密集，形状趋于椭圆且对应的响应曲面走势陡峭，表明交互作用的响应值的影响显著。由此可知，超声时间与超声温度、超声时间与聚乙二醇质量分数和超声温度与聚乙二醇质量分数对大蒜辣素提取量的交互作用对响应值的影响显著，这与方差分析结果一致。

图5 不同处理因素交互作用对大蒜辣素提取量的响应面和等高线图Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects on extraction efficiency of allicin

2.2.3 验证试验 通过Design-Expert 8.0.6 软件分析优化，预测在稳定状态下从大蒜中提取大蒜辣素、多糖最佳工艺条件为：PEG 质量分数为23.7%，超声温度为34.7 ℃，超声时间为51.2 min。此条件下大蒜辣素、多糖的提取量理论上可达3.489、42.132 mg/g。结合实际情况，将上述工艺条件修正为：PEG 质量分数为24%，超声温度为34 ℃，超声时间为50 min。并以此条件进行3次平行实验，大蒜辣素、多糖提取量分别为3.564 mg/g（RSD=0.38%）、43.86 mg/g（RSD=0.57%），实验结果与预测值十分接近，表明该模型有效可行，适用于大蒜辣素、多糖的同步提取。这与前期从大蒜中单独提取大蒜辣素或多糖工艺研究[9,18,23]相比，TPP 法同步提取大大提高了提取效率，更能充分利用大蒜资源，具有极大的应用优势。

2.3 大蒜辣素提取液稳定性试验结果

由表5可知，大蒜辣素溶液在室温放置下随时间的延长而提取量降低，大蒜辣素溶液在4 h 内较为稳定，无显著性差异（P＞0.05），在4 h 后显著降低（P＜0.05）。因此，用此种方法提取后需要在4 h 内对大蒜辣素进行测定或冷冻干燥处理保存。

表5 大蒜辣素提取液稳定性试验Table 5 Stability test of allicin capsaicin extract

3 结论

本研究采用响应面法优化三相分配体系同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖，获得的最佳提取工艺条件为：聚乙二醇质量分数24%，超声温度34 ℃，超声时间50 min，此条件下按干燥品计算大蒜辣素和多糖的提取量可达3.564、43.86 mg/g。三相分配体系与其他提取方法相比具有明显的优势，提取条件温和，操作简便高效，不仅极大地保护了大蒜辣素的生物活性，又将多糖与蛋白质分开，获得较高纯度的多糖提取液，具有经济和绿色双重效应，实验得到的最佳提取参数稳定可行，为后续进一步从大蒜中快速、廉价的提取、回收活性成分提供一定的指导作用。此外，还可将三相分配体系与酶辅助、高压均质预处理、微波辅助等辅助工艺相结合，提高TPP 法的效率，发展更方便、快捷的三相分配体系。三相分配法在大蒜活性成分提取这一领域的应用有待于更加深入的研究。