乙酰化玉竹多糖的合成工艺优化

吕 伟，陈子龙，刘思美，尹秀丽，张丽华，赵 鹏

(1.陕西省药品和疫苗检查中心，陕西 西安 710065；2.渭南市食品药品检验所，陕西 渭南 714000；3.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046)

玉竹为百合科植物玉竹(Polygonatumodoratums(Mill.)Druce)的干燥根茎，也被称为玉参、铃铛菜、甜草根等[1]，广泛分布于我国西南地区，是一种历史悠久的药食两用药材[2-4]。多糖是玉竹的主要活性成分之一，具有降血糖、抑菌、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、调节糖脂代谢等多种生理活性[5-6]。对多糖进行化学修饰可赋予其一些新的理化性质，提高其生物活性，是目前多糖研究的热点之一[7]。其中乙酰化是最常见的多糖修饰方法，多糖经乙酰化修饰后，其抗氧化和抗肿瘤活性均得到一定程度的提高[8-9]。

目前，对于玉竹多糖的研究多集中在分离纯化、结构分析和活性评价等方面，而通过乙酰化来提高玉竹多糖活性的研究尚未见报道。基于此，作者通过乙酸酐法合成乙酰化玉竹多糖，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化乙酰化玉竹多糖的合成工艺，以期为玉竹多糖的深入开发提供一定的研究基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

玉竹饮片，购于陕西省西安市万寿路中药材批发市场，经陕西中医药大学赵鹏教授鉴定为百合科植物玉竹(Polygonatumodoratums(Mill.)Druce)的干燥根茎。

β-D-五乙酰葡萄糖标准品、透析袋(MW=3500)，上海源叶生物科技有限公司；乙酸酐、浓硫酸、苯酚、氢氧化钠等试剂均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

UV-2550型紫外可见分光光度仪，上海爱朗仪器有限公司；FA2004型电子天平，上海民桥精科天平厂；TDZ5-WS型台式离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；4.5 L型真空冷冻干燥机，美国Labconco公司；RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 乙酰化玉竹多糖的合成

1.2.1 玉竹多糖的提取

称取干燥后的玉竹饮片300 g，粉碎过60目筛，加入12倍质量的水，加热至微沸并保持1.5 h，过滤，得滤液；药渣加入10倍质量的水再提取1.5 h，过滤；合并滤液，浓缩至原体积的10%，浓缩液冷却至室温，加入4倍体积的无水乙醇醇沉；醇沉结束后静置24 h，抽滤，将滤饼于80 ℃下烘干，即得玉竹粗多糖。将粗多糖配成饱和溶液，利用Sevage法脱蛋白，再用双氧水法脱色；脱色后的玉竹多糖装入透析袋中，流水透析48 h，去离子水再透析24 h，透析液浓缩，冻干，即得玉竹多糖。

1.2.2 玉竹多糖的乙酰化

根据文献[10-12]的乙酰化方法，略加调整。称取3.0 g玉竹多糖，用去离子水配成饱和溶液，加入20%氢氧化钠溶液调节pH值为9.0，升温至一定温度，缓慢滴加一定量的乙酸酐；滴加结束后恒温反应，直至乙酰化反应完全；取出反应液，加入2.0 mol·L-1稀盐酸调节pH值至7.0，将反应液置于透析袋中，流水透析3 d，取出透析液，真空下浓缩成膏状物，冻干，即得乙酰化玉竹多糖。

1.3 玉竹多糖乙酰化取代度的测定

根据文献[9-10]方法绘制β-D-五乙酰葡萄糖标准曲线，拟合得到线性回归方程：A=16.714c+0.0795，R2=0.9915。β-D-五乙酰葡萄糖浓度在0.01～0.09 mg·mL-1范围内时，与吸光度线性关系较好。根据标准曲线方程，计算样品中乙酰基含量。按下式计算玉竹多糖乙酰化取代度：

1.4 乙酰化玉竹多糖的合成工艺优化

1.4.1 单因素实验

采用单因素实验分别考察反应时间(2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h)、物料比[m(乙酸酐)∶m(玉竹多糖)，1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1]、反应温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)对玉竹多糖乙酰化取代度的影响。

1.4.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，以玉竹多糖乙酰化取代度为响应值，以反应时间、物料比、反应温度为响应变量，进行响应面实验。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 反应时间的影响

在反应温度为50 ℃、物料比为1.5∶1的条件下，考察反应时间对玉竹多糖乙酰化取代度的影响，结果如图1所示。

图1 反应时间对玉竹多糖乙酰化取代度的影响

从图1可知，随着反应时间的延长，玉竹多糖乙酰化取代度逐渐增大，当反应时间为3.5 h时，取代度达到最大；继续延长反应时间，取代度呈略微下降趋势，可能是由于，反应时间过长使部分乙酰化玉竹多糖发生了分解，从而降低了取代度。因此，以3.5 h为响应面实验反应时间的中心点。

2.1.2 物料比的影响

在反应温度为50 ℃、反应时间为3.5 h的条件下，考察物料比对玉竹多糖乙酰化取代度的影响，结果如图2所示。

图2 物料比对玉竹多糖乙酰化取代度的影响

从图2可知，随着物料比的增大，玉竹多糖乙酰化取代度逐渐增大，这是由于，随着乙酸酐用量的增加，玉竹多糖与乙酰化试剂碰撞的几率增大，促进了反应的进行；当物料比为2.5∶1时，取代度达到最大；继续增大物料比，此时乙酸酐的水解速度超过了乙酰化反应速度，反应液的pH值下降，导致取代度下降。因此，确定2.5∶1为响应面实验物料比的中心点。

2.1.3 反应温度的影响

在物料比为2.5∶1、反应时间为3.5 h的条件下，考察反应温度对玉竹多糖乙酰化取代度的影响，结果如图3所示。

从图3可知，随着反应温度的升高，玉竹多糖乙酰化取代度呈迅速增大的趋势，当反应温度为60 ℃时，取代度达到最大；继续升高反应温度，取代度逐渐下降。这可能是由于，反应温度的升高，有助于增强底物的反应活性，使得取代度增大；当反应温度超过60 ℃后，过高的反应温度可能使乙酸酐的水解速度超过了乙酰化反应速度，反应液的pH值下降，并造成部分乙酰化玉竹多糖发生了分解，导致取代度下降。因此，确定60 ℃为响应面实验反应温度的中心点。

图3 反应温度对玉竹多糖乙酰化取代度的影响

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果

响应面实验的因素与水平见表1，结果见表2。

表1 响应面实验的因素与水平

表2 响应面实验设计及结果

回归模型的方差分析见表3。

表3 方差分析

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用对玉竹多糖乙酰化取代度影响的响应面图如图4所示。

图4 各因素交互作用对玉竹多糖乙酰化取代度影响的响应面图

响应面及所对应的等高线可反映单因素交互作用影响的显著性，响应面趋于圆形，说明两因素的交互作用影响不显著；反之，响应面趋于椭圆形，说明两因素的交互作用影响显著[15-17]。由图4可知，3个因素之间的交互作用影响均较大。其中，反应温度的曲线最为密集陡峭，其对玉竹多糖乙酰化取代度的影响最大。

对回归方程求一阶偏导并使之等于0[18]，X1=-0.12，X2=0.431，X3=-0.258，由此可得预测的乙酰化玉竹多糖的最佳合成工艺如下：反应时间为3.44 h、物料比2.7155∶1、反应温度为57.42 ℃，取代度预测值为0.358。综合考虑预测的实验结果及实际操作可行性，将乙酰化玉竹多糖的最佳合成工艺调整为：反应时间3.44 h、物料比为2.7155∶1、反应温度60 ℃，在此条件下进行3次验证实验，取代度平均值为0.351。表明通过响应面法预测的玉竹多糖乙酰化取代度与实际值基本吻合。

3 结论

通过乙酸酐法合成乙酰化玉竹多糖，确定最佳合成工艺如下：反应时间为3.44 h、物料比m(乙酸酐)∶m(玉竹多糖)为2.7155∶1、反应温度为60 ℃，在此条件下，玉竹多糖乙酰化取代度为0.351。该工艺路线可行，具有反应条件温和、试剂廉价易得、多糖乙酰化取代度较高、易于放大生产等优点，是一种较理想的多糖乙酰化修饰方法。