响应面法优化婺源皇菊总黄酮的超声辅助溶剂提取工艺

张思懿，许宁侠*，方晓艾，崔 宁，王 培，陈 伶，高 健，李晨茜

(1.西安外事学院医学院，陕西 西安710077；2.精准抗衰健康产品研发与转化陕西省高校工程研究中心，陕西 西安710077)

婺源皇菊(WuyuanChrysanthemummorifolium)是菊科菊属多年生植物，其性味甘、苦、微寒，归肺、肝经，在我国有着悠久的种植及食用历史[1]。现代研究表明，皇菊的主要化学成分为黄酮类[2]、多糖类[3]、水溶性色素类[4]、挥发油类[5]等，具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血压、抑制血小板聚集、增加冠状动脉血流量、抗氧化、抗癌等药理作用[6]。从皇菊中获取黄酮类化合物，具有来源丰富、简单易得等优点。

黄酮类化合物的提取通常采用溶剂萃取法、酶辅助提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等。其中，溶剂萃取法因成本低、简单易行，应用较为广泛。杨琳琳[7]采用乙醇回流法提取黑心菊花瓣中黄酮类化合物，黄酮提取率为4.719%。饶桂维等[8]采用超声辅助水提法提取婺源皇菊总黄酮，发现存在耗时较长、提取率较低、提取物较难分离等缺点。超声辅助溶剂提取法具有一定的优势，如郑晓文[9]发现，采用超声辅助乙醇法提取皇菊总黄酮，其总黄酮提取率高于单纯的乙醇提取法。目前，关于皇菊总黄酮的提取研究多数基于金丝皇菊，而对婺源皇菊总黄酮的超声辅助溶剂提取研究鲜有报道。鉴于此，作者在单因素实验的基础上，采用响应面法优化婺源皇菊总黄酮的超声辅助溶剂提取工艺，在常规考察3因素的基础上，同时考察离心速率对总黄酮提取率的影响[10]，并对婺源皇菊总黄酮的体外抗氧化活性进行评价，以期为婺源皇菊的进一步开发与利用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

婺源皇菊，江西歙县峰日茶菊有限公司。经西安外事学院王汉屏教授鉴定为菊科菊属皇菊。

无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢，福晨天津化学试剂有限公司；L-抗坏血酸，美国Sigma-Aldrich 公司；芦丁标准品(纯度>98%)，上海如吉生物科技发展有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

UV-mini1258型紫外可见分光光度计，日本株式会社岛津；SB25-12DTD型超声波清洗机，宁波新芝；高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品200.0 mg，用50%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，得浓度为2.0 mg·mL-1的芦丁标准溶液。精密吸取芦丁标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，采用 NaNO2-Al(NO3)3法[11]测定510 nm 处吸光度，以50%乙醇为空白对照，测定3次，结果取平均值。以芦丁浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为：A=1.555c+0.0151，R2=0.9994。表明芦丁浓度在0.2～1.2 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

1.3 婺源皇菊总黄酮的提取

将婺源皇菊花萼在60 ℃下干燥至恒重，粉碎后，过 80目筛，备用。准确称取婺源皇菊粉末1.0 g，加入一定体积分数的乙醇，充分摇匀后，进行超声提取，共提取3次，合并提取液；将提取液在一定转速下离心10 min，取上清液，得到婺源皇菊总黄酮提取液。

精密量取 1 mL婺源皇菊总黄酮提取液置于50 mL 容量瓶中，采用 NaNO2-Al(NO3)3法[11]测定510 nm 处吸光度，根据标准曲线方程计算总黄酮浓度，按式(1)计算婺源皇菊总黄酮提取率。

(1)

式中：c为提取液中总黄酮浓度，mg·mL-1；n为稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为婺源皇菊粉末质量，g。

1.4 婺源皇菊总黄酮提取工艺优化

1.4.1 单因素实验

分别考察乙醇体积分数(50%、60%、70%、75%、95%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、超声时间(20 min、30 min、50 min、60 min、90 min)、离心速率(1 500 r·min-1、2 500 r·min-1、3 500 r·min-1、5 500 r·min-1、6 000 r·min-1)对婺源皇菊总黄酮提取率的影响。

1.4.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，以乙醇体积分数、料液比、超声时间和离心速率为变量，以总黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计4因素3水平实验，进行响应面分析。使用Design-Expert 8.0.6软件进行数据处理和分析，通过ANOVA分析实验结果[12]。

1.5 体外抗氧化活性评价

将婺源皇菊总黄酮提取液分别配成浓度为0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1的样品溶液。精密吸取1 mL样品溶液置于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL 9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液、1 mL 9 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液，加水至刻度，摇匀，37 ℃水浴30 min后，冷却，测定510 nm处吸光度(A1)；以无水乙醇为对照组(A0)，以水为空白组(A2)；以同浓度的VC作为阳性对照。按式(2)计算羟基自由基清除率。

(2)

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对婺源皇菊总黄酮提取率的影响(图1)

注：超声时间60 min、料液比1∶30、离心速率3 500 r·min-1

由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，婺源皇菊总黄酮提取率先升高后降低，当乙醇体积分数为70%时，总黄酮提取率达到最高，为22.95 mg·g-1。可能是因为，乙醇与总黄酮的极性相似，根据相似相溶原理，当乙醇体积分数增大时，总黄酮提取率随之上升；但当乙醇体积分数过大时，醇溶性物质如蛋白质等溶出增多，从而导致总黄酮提取率降低。因此，选择乙醇体积分数为70%。

2.1.2 料液比对婺源皇菊总黄酮提取率的影响(图2)

注：超声时间60 min、乙醇体积分数70%、离心速率3 500 r·min-1

由图2可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，婺源皇菊总黄酮提取率逐渐降低，当料液比为1∶10时，总黄酮提取率最高，为37.51 mg·g-1。可能是因为，在适当的料液比范围内溶质分散良好，加热效率高，有利于总黄酮分子的释放，总黄酮提取率较高；但提取溶剂用量过多时，其它成分溶出，导致单位体积内总黄酮的分子数减少。因此，选择料液比为1∶10。

2.1.3 超声时间对婺源皇菊总黄酮提取率的影响(图3)

注：乙醇体积分数70%、离心速率3 500 r·min-1、料液比1∶30

由图3可知，随着超声时间的延长，婺源皇菊总黄酮提取率先升高后降低，当超声时间为50 min时，总黄酮提取率达到最高，为23.46 mg·g-1。可能是因为，在50 min内，婺源皇菊细胞内黄酮类化合物溶出速率较快，总黄酮提取率显著提高；超过50 min后，由于超声波的机械效应和热能加快了分子运动，进而破坏了黄酮类化合物的结构，另外超声时间过长，促使其它成分溶出，导致总黄酮提取率降低。因此，选择超声时间为50 min。

2.1.4 离心速率对婺源皇菊总黄酮提取率的影响(图4)

注：超声时间50 min、乙醇体积分数70%、料液比1∶30

由图4可知，随着离心速率的加快，婺源皇菊总黄酮提取率先升高后降低，当离心速率为3 500 r·min-1时，总黄酮提取率达到最高，为22.85 mg·g-1。通过离心分离，高速旋转产生的离心力远远大于重力，可大大提高较细物质的沉降速率，只需较短的时间即可达到较好的分离效果。因此，选择离心速率为3 500 r·min-1。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果(表1)

采用Design-Expert 8.0.6软件对表1数据进行处理，得到二次多元回归模型方程:Y=39.74+3.68A+7.2B+0.87C+0.6D-1.4AB+8.93×10-3AC+3.76AD+0.66BC-0.45BD-0.29CD-170A2-794B2-62C2+40D2。

回归模型的方差分析见表2。

表2 回归模型的方差分析

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用对婺源皇菊总黄酮提取率影响的响应面图及等高线图如图5所示。

图5 各因素交互作用对婺源皇菊总黄酮提取率影响的响应面图及等高线图

由图5可知，婺源皇菊总黄酮提取率随乙醇体积分数、料液比、超声时间和离心速率的上升而升高，到达中心点后呈下降趋势。料液比对总黄酮提取率的影响大于乙醇体积分数[13-15](图5a)。通过分析响应面图发现，乙醇体积分数与料液比、料液比与离心速率的交互作用明显，表现为曲线较陡，响应值变化较大；乙醇体积分数与超声时间、超声时间与离心速率的交互曲线较为平滑，响应值变化较小。通过分析等高线图发现，乙醇体积分数与料液比的交互作用对总黄酮提取率的影响最显著，表现为等高线最密集；料液比与超声时间的交互作用对总黄酮提取率的影响次之，超声时间与离心速率的交互作用对总黄酮提取率的影响最不明显。

2.3 最佳工艺的确定

通过响应面分析，预测婺源皇菊总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数72%、料液比1∶10(g∶mL)、超声时间44.48 min、离心速率2 700 r·min-1。考虑实际操作的可行性，将最佳提取工艺条件修正为：乙醇体积分数70%、料液比1∶10、超声时间45 min、离心速率2 700 r·min-1，在此条件下，总黄酮提取率为39.943 mg·g-1，与模型预测值(40.950 mg·g-1)相差不大，说明响应面优化回归模型对实际工艺操作具有一定的指导意义。

2.4 体外抗氧化活性

婺源皇菊总黄酮对羟基自由基的清除率如图6所示。

图6 婺源皇菊总黄酮对羟基自由基的清除率

从图6可知，婺源皇菊总黄酮和VC对羟基自由基的清除率均随浓度的增加而升高，当婺源皇菊总黄酮浓度由0.1 mg·mL-1增至0.8 mg·mL-1时，羟基自由基清除率从72.28%升至79.60%。由此可见，婺源皇菊总黄酮具有明显的抗氧化能力。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化婺源皇菊总黄酮的超声辅助溶剂提取工艺，确定最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数70%、料液比1∶10(g∶mL)、超声时间45 min、离心速率 2 700 r·min-1，在此条件下，婺源皇菊总黄酮提取率为 39.943 mg·g-1，与模型预测值(40.950 mg·g-1)相差不大，表明该模型拟合度较好。此外，通过单因素实验发现，离心速率在3 500 r·min-1时，婺源皇菊总黄酮提取率达到最高(22.85 mg·g-1)，可知离心速率对总黄酮提取率有一定的影响，该机制有待后期进一步深入研究。体外抗氧化实验结果表明，婺源皇菊总黄酮对羟基自由基具有明显的清除活性，具有一定的潜在开发价值，可作为一种新型的抗氧化剂应用于药品、食品及化妆品等领域。后期可对婺源皇菊总黄酮体内抗氧化活性及抗氧化机理进行更深入的研究。