抗黑曲霉乳酸菌筛选及其抑菌稳定性研究

蒋木培，李影彤，张舒宁，赵晨惠，钟先锋，2，3，4，5，王阿利，2，3，4，5

1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528225；2.广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东 佛山 528225；3.广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，广东 佛山 528225；4.佛山市酿造工程技术研究中心，广东 佛山 528225；5.佛山市农业生物制造工程技术研究中心，广东 佛山 528225）

黑曲霉在适宜温度、湿度等环境条件下易大量生长繁殖，引起果蔬［1］、粮食［2-3］、饲料［4］等腐败变质。寻找抑制黑曲霉生长的有效拮抗物质或微生物已成为食品、饲料等行业保藏防腐研究的重要方向。乳酸菌普遍被认为是安全的功能性益生菌，其产生的有机酸［5］、脂肪酸［6］、酚类抗生素［4］、蛋白质［7］等物质对真菌具有较好的抑制作用，是一类重要的真菌拮抗剂。VALERIO 等［8］从意大利小麦粗面粉中分离的Leuconostoc citreumC 2-27、Lactobacillus rossiaeC 21-11、Weissella cibariaC 21-4 对黑曲霉的抑制率高达98%。QUATTRINI 等［9］研究的谷物源Lactobacillus plantarumITEM 17215 及其产生的苯甲酸、对羟基苯乳酸、3-苯乳酸、乳酸和乙酸等对黑曲霉生长具有协同抑制作用。乳酸菌是抑制黑曲霉生长潜在的优良菌种资源，但作为生物拮抗剂应用时普遍存在不易保存、活性不稳定等问题，挖掘高效且稳定的抗黑曲霉乳酸菌拮抗剂，将在食品保藏防腐中具有重要意义。

本文以前期从酱油渣中分离鉴定的14 株乳酸菌为出发菌株［10-12］，拟筛选具有抑制黑曲霉生长作用的乳酸菌，并进一步研究菌株及其上清液在不同条件下抗菌活性的稳定性，以期为抑制黑曲霉生长乳酸菌拮抗剂的研究及应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验菌株：本实验室前期从酱油渣中筛选鉴定的14 株乳酸菌，分别是：副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HT 51、HT 90、HT 111、HT 155、HT 158、HT 159、HT 160、HT 197、HT 253、HT 256；乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）HT 102、HT 127、HT 223、HT 227［10-12］。黑曲霉（Aspergillus nigerATCC 16404）购于北京北纳创联生物技术研究院。

MRS 肉汤培养基、MRS 固体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉，北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠、氢氧化钠、盐酸，天津市大茂化学试剂厂；甘油，广州化学试剂厂；胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

EPOCH2 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；SW-CJ-1FD 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；ME104 电子分析天平，梅特勒-托利多精密仪器（上海）有限公司广州分公司；MS-01H 磁力搅拌器，美国精骐有限公司；LRH-150 生化培养箱，上海一恒科学仪器；Allegra 64R 冷冻高速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；GR60DA 全自动灭菌锅，致微（厦门）仪器；BCD-189WDPV 防冻霜冰箱，青岛海尔股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌发酵上清液的制备

根据文献［13］方法，将培养48 h 的乳酸菌发酵液离心，取上清液，0.45 μm 滤膜过滤收集，4 ℃保存备用。

1.3.2 黑曲霉孢子悬液的制备

根据文献［14］方法，将黑曲霉孢子悬液离心，取上清液，灭菌纱布过滤，制成单孢子悬液，4 °C 保存备用。

1.3.3 乳酸菌抑制黑曲霉生长活性测定

乳酸菌菌体抑制黑曲霉生长活性测定：根据文献［15］方法，取5 mL 混有黑曲霉孢子悬液的PDA培养基倾倒至MRS 培养基上，待凝固后，28 ℃培养48 h。观察乳酸菌周围是否有黑曲霉生长。

乳酸菌发酵上清液抑制黑曲霉生长活性测定：根据文献［16］方法，取黑曲霉孢子悬液添加到含乳酸菌发酵上清液的96 孔无菌培养板中，28 ℃培养48 h，测定OD600nm值，计算抑菌率。抑菌率为

式中，ODLAB表示孢子悬液在乳酸菌发酵上清液中培养48 h 后的OD600nm；ODLAB*表示孢子悬液在乳酸菌发酵上清液中起始的OD600nm；ODcontrol表示孢子悬液在MRS 培养基中培养48 h 后的ODcontrol；ODcontrol*表示孢子悬液在MRS 培养基中起始的OD600nm。

1.3.4 pH 对乳酸菌发酵上清液抑制黑曲霉生长活性的影响

将乳酸菌发酵上清液pH 值，分别调至3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5，比较不同pH 处理后乳酸菌发酵上清液对黑曲霉生长的抑制作用。

1.3.5 温度对乳酸菌发酵上清液抑制黑曲霉生长活性的影响

将乳酸菌发酵上清液分别经50 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃处理30 min，比较不同温度处理后乳酸菌发酵上清液对黑曲霉生长的抑制作用。

1.3.6 蛋白酶对乳酸菌发酵上清液抑制黑曲霉生长活性的影响

将乳酸菌发酵上清液调至最适pH，并分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶室温处理4 h，比较经不同蛋白酶处理后样品对黑曲霉生长的抑制作用。

1.4 统计分析

采用SPSS 25.0 软件对实验数据进行一般线性模型的单变量分析，采用origin 2021 软件进行绘图。本研究所有实验重复3 次及以上，数据表现形式为：平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 抑制黑曲霉生长的乳酸菌筛选

2.1.1 乳酸菌菌体对黑曲霉生长活性的影响

采用双层平板拮抗法，筛选对黑曲霉生长抑制效果较好的菌株，结果如表1 所示。抑菌活性较强的菌株为乳酸乳球菌HT 223 和HT227，平板上无黑曲霉生长；抑菌活性中等的菌株为：副干酪乳杆菌HT 155、HT 158、HT 159、HT 253，黑曲霉生长较少；抑菌活性弱的菌株为：乳酸乳球菌HT 102 和副干酪乳杆菌HT 51、HT 160、HT 256，黑曲霉生长明显，且与乳酸菌分界模糊；无抑菌活性的菌株为：乳酸乳球菌HT 127 和副干酪乳杆菌HT 90、HT 111、HT 197，黑曲霉生长旺盛，无法看出乳酸菌生长区域。结果表明酱油渣源乳酸乳球菌和副干酪乳杆菌具有一定的抗黑曲霉活性。贾俊伟［17］采用双层平板拮抗法和牛津杯法从自制奶豆腐中筛选出2 株抗黑曲霉的副干酪乳杆菌N 17 和N 29，与本研究结果相近。

表1 乳酸菌对黑曲霉的抑菌效果

2.1.2 乳酸菌发酵上清液对黑曲霉生长活性的影响

采用96 孔板法测定14 株乳酸菌发酵上清液对黑曲霉的抑菌效果，结果如表2 所示。14 株乳酸菌发酵上清液对黑曲霉的抑制率为74%～88%。其中乳酸乳球菌HT 223 对黑曲霉生长的抑制作用最强，副干酪乳杆菌HT 51 和159 次之。结合乳酸菌菌体对黑曲霉生长的抑制结果，筛选出乳酸乳球菌HT 223 的菌体和发酵上清液对黑曲霉抑制作用最好，可进一步研究该菌株发酵上清液的抑菌稳定性。

表2 乳酸菌发酵上清液对黑曲霉的抑菌率

2.2 乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑制黑曲霉生长的稳定性

2.2.1 pH 对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌效果的影响

研究证实乳酸菌代谢形成的酸性环境有助于抑菌活性物质发挥抑制作用［18］。乳酸乳球菌HT 223发酵上清液抑菌活性对pH 的敏感性如图1 所示。菌株HT 223 对黑曲霉的抑菌率随pH 升高而降低，且发酵上清液抑菌活性在pH 3.5～5.5 环境下耐受性较强，抑菌率均大于70 %，但在pH 6.0～7.5 环境下的抑制作用显著下降（P＜0.05）。结果表明，乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液在酸性条件下（pH 3.5～5.5），对黑曲霉的抑菌活性稳定。OLASUPO 等［19］研究发现，从乳制品中分离出的乳酸乳球菌BFE 1500 的抑菌活性物质在低pH（2～4）环境下具有最高活性，且稳定性较好，与本研究结果相近。

图1 pH 对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌活性的影响

2.2.2 温度对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌效果的影响

温度是影响乳酸菌抑菌活性物质稳定性的重要因素［20］。菌株HT 223 发酵上清液经不同温度处理后，对黑曲霉抑菌效果的变化情况如图2 所示。当发酵上清液经50 °C、80 °C、100 °C 处理后，菌株HT 223 的抑菌率仍保持在88 %左右，经121 °C 处理后，抑菌率仅降低了2.96 %。不同温度处理与对照组相比，发酵上清液对黑曲霉的抑制活性无显著变化（P＞0.05），表明乳酸乳球菌HT 223 中抑菌物质具有良好的热稳定性。这一结果与BARMAN 等［21］研究自制酪乳源乳酸乳球菌霍氏亚种LABW1、LABW3和乳酸乳球菌乳酸亚种LABW4 发酵上清液，经121 ℃处理15 min 后抑菌物质保持稳定的结果一致。

图2 温度对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌活性的影响

2.2.3 蛋白酶对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌效果的影响

乳酸菌可产生蛋白质类物质来抑制真菌的生长［22］，本文研究了不同蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶）处理对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液中抑菌活性物质的影响，结果如图3所示。经胃蛋白酶处理后，菌株HT 223 发酵上清液的抑菌活性无显著变化（P＞0.05）；经胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶处理后，抑菌率显著下降（P＜0.05）。结果表明，乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌活性对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶敏感。推测菌株中的抑菌物质易被这些蛋白酶降解，通过改变蛋白质功能特性而导致抑菌活性丧失［23］。GOYAL 等［24］研究了乳制品源乳酸乳球菌乳酸亚种63 发酵上清液中的抑菌活性物质经木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶处理后，抑菌活性显著下降，甚至丧失全部活性。本研究结果与其相似，但经胃蛋白酶处理后抑菌活性差异较大，推测与胃蛋白酶的来源有关，胃蛋白酶生产工艺不同，所生产胃蛋白酶的活力存在较大差异［25］。

图3 蛋白酶对乳酸乳球菌HT 223 发酵上清液抑菌活性的影响

3 结论

本研究以实验室前期从酱油渣中分离得到的14 株乳酸菌为试验菌株，采用双层平板拮抗法和96孔板法筛选对黑曲霉具有良好抑制作用的乳酸菌，并从pH、温度、蛋白酶处理条件下研究筛选菌株抑菌活性的稳定性。结果表明：乳酸乳球菌HT 223 抑制效果最强，其发酵上清液抑菌率达到了88%；菌株HT 223 发酵上清液在pH 3.5～5.5 环境下抑菌活性稳定；温度对菌株发酵上清液抑菌效果无显著影响；菌株发酵上清液对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶敏感。综上，乳酸乳球菌HT 223 对黑曲霉具有较好的抑制能力，发酵上清液的抑菌活性对酸和高温具有较强的耐受性。菌株HT 223 可作为控制黑曲霉生物防霉剂的候选菌株，后续可研究菌株产生的抑菌物质及其抑菌作用机理，为菌株应用于果蔬、粮食、饲料等生物防腐保藏提供科学依据。