金纳米颗粒和多壁碳纳米管协同增敏的维生素C传感器的研制与应用

栗云鹏，施玉峰，巫彬芳，周 华，施震渺，李松浩，徐海涛，兰玉彬，龙拥兵

(华南农业大学 电子工程学院/国家精准农业航空施药技术国际联合研究中心, 广东 广州 510642)

近年来，现代农业技术发展日新月异，智慧农业概念也应运而生。智慧农业是现代信息技术与农业的深度融合，其关键是基于农业传感器的农业信息的高效获取[1-2]。目前，高端农业传感器主要依赖进口，农业专用传感器的种类和功能还不够完善，大多数农业传感器用于农情监测[3]，适用于检测农作物本身生理状况的农业传感器还比较少。维生素 C(Vitamin C，VC)又称抗坏血酸 (Ascorbic acid，AA)，是植物自身合成的抗氧化剂，在清除自由基、提高植物抗胁迫能力方面起着重要作用[4]。维生素C还是重要的农产品品质指标之一[5]，有研究指出外施抗坏血酸可以提升大豆产量[6]。因此，发展农用维生素C传感器，确立快速测定农产品中维生素C含量的有效手段，对支撑农产品品质的高效准确鉴定具有重要意义。维生素C含量的测定主要采用液相色谱法[7]、比色法[8]、荧光法[9]、碘滴定法[10]、分光光度法[11]和滴定法[12]。上述测定方法大都需要送样至专业实验室进行检验，所需检测设备昂贵，样品前处理工序复杂、需时较长。电化学传感分析技术具有许多优点，如传感器检测针对性强、功能可定制、设备成本低、样品前处理简单、可通过便携式设备实现现场快速检测等[13-15]。当前，维生素C电化学传感器的报道更多是针对药物[16]、饮料[17]以及动物[18]方面，关于植物中维生素C的电化学传感器研究较少。因此，基于电化学传感法开发一种适用于植物内环境的维生素C传感器具有巨大的应用价值。电化学传感器的开发关键在于选择合适的电极基底和构建高效敏感膜结构实施增敏。相比于常用的玻碳电极和碳糊电极，铅笔芯电极(Pencil graphite electrode，PGE)具有高化学和机械稳定性、宽工作电压和低背景电流等优点，可作为传感器基底的优选方案之一[19-22]。另外，电极敏感层品质的好坏将极大地影响传感器性能。金纳米颗粒具有良好的导电性、催化性和生物相容性，用于修饰电化学传感电极表现出很强的维生素C氧化能力[18,23-24]，但其容易和有机物相结合，导致敏感层污染失效[18]。多壁碳纳米管 (Multi walled carbon nanotubes，MWCNTs)具有中空的多层管状结构，该特殊结构令其具有大比表面积、良导电性和强吸附性，可促使电子快速转移以分解众多有机物而具备优秀的抗污染能力[25-26]。采用多种纳米材料协同构建敏感膜增效，是优化电化学传感器性能的有效手段。因此，本研究将采用低成本、高稳定的铅笔芯作为传感器电极基底，以金纳米颗粒和多壁碳纳米管协同构建敏感膜，制备MWCNTs/Au/PGE电极，并将其应用于果蔬中，实现维生素C含量的快速检测。本研究结果将为农业传感器的专用开发和植物本体信息的快速测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

二甲基甲酰胺(DMF)、L-抗坏血酸、L-苹果酸(C4H6O5)、柠檬酸、氯化钾 (KCl)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、亚铁氰化钾 (K4Fe(CN)6·3H2O)均购自广州化学试剂厂。氯金酸(AuCl4H)购自思域化工，多壁碳纳米管购自先丰纳米公司，磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自飞净生物公司，HB铅笔芯(0.5 mm)购自得力公司，热缩管(0.6 mm)购自于伊莱科公司。试验所用水溶液均采用超纯蒸馏水配置。

1.2 试验仪器和测试方法

试验仪器主要有扫描电子显微镜(SEM，ZEISS公司)、能量色散谱仪(EDS，ZEISS公司)、X 射线光电子能谱 (XPS，Thermo Scientific公司)、拉曼光谱仪(Raman，英国牛津仪器)、电化学工作站(上海辰华公司)。

所有电化学试验均采用三电极体系，试验方法包括循环伏安法、差分脉冲伏安法和时间电流法。其中工作电极为PGE以及修饰的PGE，参比电极为饱和Ag/AgCl电极，辅助电极为铂丝电极。以 0.1 mol/L 的 PBS 作为支撑电解质，在+0.2 V 的外加电压下，研究MWCNTs/Au/PGE对维生素C的安培响应。

1.3 MWCNTs/Au/PGE传感器的制备

截取4 cm热缩管套于6 cm铅笔芯上，两端各露出1 cm，以其中一端作为传感电极。将热风枪调至200 ℃，采用热风吹扫固定热缩管，即制得裸铅笔芯电极 (PGE)。将 PGE 置于 0.1 mol/L 的 KCl和5 mmol/L 的 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]混合溶液中，采用循环伏安法筛选PGE电极。循环伏安法扫描电压为-0.2～+0.8 V，扫描速率为 50 mV/s，扫描20圈。挑选扫描后峰值电流相同的PGE电极，以纯水清洗后保存备用。

将PGE电极置于0.2 mmol/L氯金酸溶液中，采用时间电流法，通过施加负电压还原氯金酸制备金纳米颗粒，所用沉积电压为-0.2 V，沉积时间为8 s，制得金纳米颗粒铅笔芯电极(Au/PGE)。采用物理吸附法沉积多壁碳纳米管，首先将200 mg多壁碳纳米管分散于40 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，制得5 mg/mL的MWCNTs/DMF溶液，超声震荡 15 min。然后将 Au/PGE前端 1 cm 浸没于MWCNTs/DMF溶液10 min，取出自然风干，重复2次，即可制得多壁碳纳米管和金纳米颗粒修饰的铅笔芯电极(MWCNTs/Au/PGE)。最后用纯水清洗电极表面，晾干保存备用。

2 结果与分析

2.1 MWCNTs/Au/PGE的表征

2.1.1 电极表面形貌表征 采用扫描电镜分别观察Au/PGE和MWCNTs/Au/PGE电极表面，结果如图1a和1b所示。由图1a可见，Au/PGE电极表面沉积了大量分散状的金纳米颗粒；进一步修饰多壁碳纳米管后，在图2b中可见弯曲的多壁碳纳米管和金纳米颗粒相互吸附，沉积于电极表面。采用EDS分析MWCNTs/Au/PGE的元素组成，在图1c中以红框标出采集区，图1d结果表明，修饰电极表面仅存在金和碳元素。

图1 电极表面纳米结构形貌和成分表征Fig.1 Nanostructure morphology and composition characterization of electrode surface

2.1.2 电极表面纳米结构成分表征 图1e 展示了MWCNTs/Au/PGE电极3个修饰阶段的拉曼光谱，可见归属于碳的3个特征峰，分别为D峰(1 338～1 352 cm-1)、G 峰 (1 568～1 583 cm-1)和 2D 峰 (2 689～2 701 cm-1)。其中D峰强度与碳的边缘缺陷和无序程度相关，G峰反映了样品中碳的石墨化程度。结果表明，PGE电极的主要成分是石墨粉末；沉积金纳米颗粒后，拉曼峰强度均增加，表明金纳米颗粒增强了电极的拉曼响应；修饰多壁碳纳米管后，3个拉曼峰的半峰宽均变小，而代表有序堆叠结构的2D峰峰强显著提升，结合文献[27]可得，有序结构的多壁碳纳米管确实已附着在修饰电极表面。

MWCNTs/Au/PGE电极的表面化学成分采用XPS进行测定，扫描全谱图1f显示其主要的元素组成为C、Au、O和N。图1g为Au 4f的精细图谱，在结合能83.8和87.5 eV处存在1对双峰，对应于 Au 4f7/2和 Au 4f5/2的能级，综合文献 [28]结果，证实了氯金酸还原后是以单质金的形式形成金纳米颗粒。图1h为C 1s的精细图谱，确认了C—C和C＝C键的存在，其主要来自于多壁碳纳米管和铅笔芯中的石墨。

2.2 MWCNTs/Au/PGE维生素C传感器的电催化性能

循环伏安法对比了修饰有不同纳米材料的电极催化性能。在含0.1 mol/L的KCl和5.0 mmol/L的 Fe(CN)63-/4-的溶液中依次测试 PGE、MWCNTs/PGE、Au/PGE和MWCNTs/Au/PGE电极，结果如图2a所示。在PGE的循环伏安谱上可观察到1对氧化还原峰；分别修饰金纳米颗粒和多壁碳纳米管之后，峰电流增强，说明修饰纳米材料可促使更多的Fe(CN)63-/4-到达电极表面；峰电位差减小，说明修饰纳米材料还可以增强溶液和电极表面的电子转移[29]。同时修饰2种纳米材料，峰电流的增强最为显著，这说明共同修饰两种纳米材料可协同增强电极催化电流。

图2 MWCNTs/Au/PGE的电化学性能Fig.2 Electrochemical performance of MWCNTs/Au/PGE

根据Randles-Sevcik方程，电极有效表面积(A)按照公式(1)计算。

式中，Ip是峰值电流，n是电子转移数，v是扫描速率，C0是反应物浓度，即Fe(CN)63-/4-的浓度，D0是Fe(CN)63-/4-的扩散系数 (0.65×10-5cm2·s-1)[30]。通过计算可得，PGE的有效面积为0.128 cm2，MWCNTs/Au/PGE的有效面积为0.204 cm2，比PEG增加了59.3%，金纳米颗粒和多壁碳纳米管所组成的混合纳米结构协同提升了电极的有效反应面积，从而增强了催化电流。

在50 μg/g的维生素C标准液中，采用差分脉冲伏安法探究MWCNTs/Au/PGE对维生素C响应的提升效果，结果如图2b所示，MWCNTs/Au/PGE性能最优，其峰电位减小了80 mV，峰电流提升2.01倍，结合文献[31]结果充分说明，MWCNTs/Au/PGE对维生素C具有优异的电催化活性，因此共同修饰多种纳米材料是提升传感器性能的有效策略。

采用循环伏安法研究了维生素C在电极表面的反应机理，结果如图2c和2d所示。在50 μg/g的维生素C标准液中进行扫描，随着扫描速率的增加，峰电流逐渐增加，氧化峰电位向正向偏移。循环伏安谱中没有还原峰，说明MWCNTs/Au/PGE表面的氧化反应是不可逆的。峰值电流与扫描速率平方根呈线性增加，结合文献[31]，说明电极表面维生素C的氧化反应主要由扩散控制。

2.3 pH对MWCNTs/Au/PGE维生素C传感器性能的影响

与人和动物相比较，植物体内的pH范围更广。在植物生长过程中由于有机酸的积累，器官中的pH变化显著。为了满足快速检测的要求，需要考虑宽pH范围内的传感器性能变化，因此，本研究还通过差分脉冲伏安法分别测试了pH=4～8范围内MWCNTs/Au/PGE对不同质量分数维生素C(20～500 μg/g)的响应，结果如图3所示。在pH=4～8范围内，MWCNTs/Au/PGE的差分脉冲伏安峰电流与维生素C质量分数均表现出良好的线性关系(图3a～3e)。由图3f可见，随着pH的增大，峰电位逐渐向负电位移动，这是由于维生素C进行氧化反应时涉及去质子化过程，高pH环境更容易促进此过程。以pH和峰电位建立线性关系，所得斜率为31 mV/pH，结合文献[32]，说明氧化过程是2个电子和1个质子的转移过程。当pH=4时，溶液中的大量质子与维生素C氧化产生的电子相结合，因而阻碍了电子向电极的流动[33]。当pH=5时，溶液质子数量变少，维生素C氧化所产生的2个电子能更容易地转移到电极上，从而产生更强的电化学信号。当pH继续增大，可能是由于纳米结构与维生素 C产生静电排斥，在 pH＞6时，维生素C(pKa=4.1)发生去质子化过程，因而在pH＞6时峰电位骤降，并在pH=8时略微上升[32]。综上所述，MWCNTs/Au/PGE可在宽pH范围内工作，适用于植物内环境下监测维生素C含量。由于pH=5时电极对维生素C响应最好，因此选择在该条件下进行时间电流法测定标准曲线。

2.4 MWCNTs/Au/PGE维生素C传感器的检测性能

时间电流法可在1～2 min内获得稳定的电流响应输出，因此，时间电流法更适合实施现场快检。为探究MWCNTs/Au/PGE对维生素C的检测性能，选择在pH=5条件下，采用时间电流法对电极进行定标，试验所用基质为pH=5的PBS，维生素C质量分数调节范围为1～500 μg/g，时间电流法检测前先等待维生素C扩散完全再开始测量，结果如图4所示，MWCNTs/Au/PGE对维生素C表现出稳定的检测性能，维生素C质量分数与响应电流呈现良好的线性关系，线性回归方程为y= 0.049 7x+0.054 7，R² = 0.998。定标结果表明，MWCNTs/Au/PGE 的灵敏度高 [0.244 μA·(μg/g)-1·cm-2]，线性检测范围达1～500 μg/g，适用于检测大部分果蔬的维生素C含量。

图4 MWCNTs/Au/PGE时间电流曲线和线性关系Fig.4 Time current curve and linear relationship of MWCNTs/Au/PGE

2.5 MWCNTs/Au/PGE维生素C传感器的抗干扰性

考虑到果蔬体液中存在大量柠檬酸、苹果酸和葡萄糖等有机物，这些有机物可能会影响传感器的维生素C检测响应，因此进行了抗干扰性测定，向PBS溶液中依次加入10 μg/g的维生素C、葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、维生素C，测定氧化电流，结果如图5所示，在添加3种干扰物后，氧化电流并未发生明显变化，电流变化均小于1.77%，并采用公式(2)计算干扰率：

图5 MWCNTs/Au/PGE抗干扰测试Fig.5 Anti-interference test of MWCNTs/Au/PGE

式中，I前、I后分别为添加干扰物前、后的电流均值。

在依次添加葡萄糖、柠檬酸和苹果酸后，经计算，其干扰率分别是1.22%、1.77%和0.64%，这说明传感器对果蔬体液中存在的常见有机物具有较强的抗干扰性。

2.6 MWCNTs/Au/PGE维生素C传感器的重复性和稳定性

由于在电化学检测中，电极的使用次数和保存时间增加会导致检测峰电流衰减，因此为确认准确性，对MWCNTs/Au/PGE电极的重复性进行试验。在180 μg/g的维生素C溶液中，同一根电极连续平行测试4次，相对标准偏差(RSD)为2.7%，说明传感器经多次使用后衰减很小，可在现场检测中重复使用以节约成本。稳定性试验是在180 μg/g的维生素C溶液中进行的，先取制备好的传感器进行测定并保存，传感器清洗后在常温常压条件下放置4周，在相同条件下测定的电流为原始值的85.3%，说明经长时间保存后传感器仍具有良好的稳定性。

2.7 MWCNTs/Au/PGE维生素C传感器的实样检测分析

为验证MWCNTs/Au/PGE在实际应用中的效果，对番茄果实中的维生素C含量进行检测，如图6所示。将成熟番茄果实鲜榨后过滤获得果汁滤液，经测定，鲜榨果汁的pH=4.9。选择pH=5的PBS为稀释液，采用实样加标法[28]，以10倍果汁稀释液为基底，加入维生素C标准液3次(5、10和20 μg/g)，根据标准曲线(图4)计算每次加标后稀释液的维生素C含量，用线性反推法求得10倍果汁稀释液的维生素C含量。加标回收率采用公式(3)计算：

图6 10倍稀释的鲜榨番茄汁中维生素C含量的测定过程Fig.6 Determination of vitamin C content in 10-fold diluted fresh tomato juice

计算结果如表1所示，10倍稀释液的维生素C质量分数为6.14 μg/g，3次加标回收率均在109%～113%之间。将电化学法与采用钼蓝比色法的测定结果相对比，2种方法所测定的维生素C含量相近，具体结果如表2所示。以上结果表明，MWCNTs/Au/PGE可以准确地检测出番茄果实中的维生素C含量，具有良好的实用性。

表1 加标回收率法电化学检测番茄汁维生素C含量Table 1 Electrochemical determination of vitamin C content in tomato juice by standard addition recovery method n=3

表2 不同方法检测番茄汁中维生素C含量Table 2 Vitamin C content in tomato juice detected by different methods n=3

3 讨论与结论

由于常温下维生素C极易被氧化，快速精确地测定维生素C含量受到挑战。基于钼蓝比色法[11]和液相色谱法[7]的实验室送检方案存在操作繁琐、成本高昂和前处理时间长等弊端，可快速响应的电化学传感法成为实现现场快检的优选方式。为发展适用于农业的维生素C传感器，本研究以金纳米颗粒和多壁碳纳米管协同修饰铅笔芯，构建了高响应的MWCNTs/Au/PGE电极。本研究采用扫描电镜、XPS光电子能谱、拉曼光谱等手段对MWCNTs/Au/PGE进行形貌和成分表征，结果表明，采用分步修饰法在铅笔芯表面成功沉积混合纳米结构。Dokur等[34]曾用金和碳纳米管修饰铅笔芯电极测定核黄素，所修饰电极活性面积较本研究小，本研究的MWCNTs/Au/PGE电极的活性面积达0.204 cm2，比PGE增加了59.3%。表明本研究所采用的分步修饰法容易构建交联的混合纳米结构，增加电极活性面积提升催化效果。为保证所制备电极能在果蔬体液pH范围内应用，试验采用差分脉冲伏安法分别测定了pH=4～8条件下的含量-电流响应曲线。所拟合线性关系良好且差异极小，在pH=5时，电极具有最大的灵敏度。试验结果与龚德状等[33]采用金磁微粒模拟酶修饰的传感器的最优pH条件相同。进一步研究测定成熟番茄汁液的pH=4.9，所以最终选择在pH=5环境下，采用时间电流法实施快检。该法测得维生素C的线性检测限为1～500 μg/g，灵敏度达 0.244 μA·(μg/g)-1·cm-2。以 10 倍稀释的鲜榨番茄汁为对象进行实测，结果与钼蓝比色法所测得的维生素C含量相近。张巧云等[17]采用纳米多孔金电化学传感器快速检测饮料中的维生素C含量，线性检测限为 6.6～160.0 μg/g，显然本研究所制备的传感器性能更优，宽检测限更适合大多数农产品的现场快检。Li等[35]采用一次性不锈钢电极检测大豆幼苗中的生长素含量，不锈钢质地坚硬易于刺入根茎，便于活体检测和读取实时数据，为实现田间植物在线持续检测提供了后续研究方向。

本研究采用分步修饰法在铅笔芯电极上沉积了金纳米颗粒和多壁碳纳米管的混合纳米结构，成功制备了一种低成本、高响应的维生素C传感器。试验结果表明，MWCNTs/Au/PGE具有宽的pH检测范围，对维生素C具有高选择性，且冷藏保存稳定性和重现性良好。对番茄果实进行检测，回收率在109%～113%之间，RSD均小于2.26%。本研究有望为快速检测果蔬维生素C含量提供新思路。