柏子养心片中非法着色剂808 猩红的测定
2022-08-02彭玲娜赵勇孙辉李文莉
彭玲娜，赵勇，孙辉，李文莉
湖南省药品检验检测研究院，湖南省药品质量评价工程技术中心，湖南 长沙 410001
柏子养心片是由炙黄芪、川芎、朱砂等十三味药材组成，具有补气、养血安神的功效［1］。组方中朱砂为生粉入药，近年来，朱砂染色掺假现象已被广泛关注和报道，808 猩红（808 scarlet）为常用的着色剂之一，其在机体内经生物转化分解，可形成致癌物，具有强致癌和致突变性［2-5］。朱砂作为柏子养心片的生产原料，有可能将808 猩红着色剂带入制剂中，因此有必要对制剂进行808 猩红的检测研究。本研究采用HPLC 和LC-MS 检测方法［6-9］，对柏子养心片中808猩红进行检测，其方法简单、稳定、重现性佳，为该品种安全性方面的质量控制提供了可靠的检验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters E2695 高效液相色谱仪（DAD 检测器）；Waters Acquity UPLC，Xevo G2 Q-TOF 质谱仪（美国，Waters 公司）；XS205 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超声波清洗（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）
1.2 试药
水为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯；808 猩红对照品（来源：中国食品药品检定研究院，批号：111940-201804）。柏子养心片（A 厂，批号：140605、140801、111101、130105、130410、111201、131007、120209、131005；B 厂，批 号：20140201、20140401、20130601）。
2 方法与结果
2.1 HPLC 条件
色谱柱：ECOSIL C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸（B）（85∶15）为流动相；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长为520 nm。
2.2 对照溶液的制备
精密称取808 猩红对照品7.20 mg，至100 mL量瓶中，加丙酮溶解并稀释至刻度，得808 猩红对照品储备液（0.072 mg/mL）；精密量取对照品储备液1 mL，至10 mL 量瓶中，加丙酮稀释至刻度，得对照品溶液（7.2 μg/mL）。
2.3 供试品溶液的制备
取样品适量，除去包衣，取约10 g，精密称定，精密加入丙酮20 mL，称重后超声处理30 min，放冷，再称定重量，用丙酮补重，滤过，取续滤液，即得。
2.4 专属性试验
2.4.1 808 猩红的HPLC 法测定分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，结果供试品呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，而阴性样品则无相应的对照品色谱峰（图1）。采用DAD 检测器检测400～600 nm 范围内的光谱图，供试品色谱峰的吸收光谱与808 猩红对照品紫外吸收光谱一致（图2）。
图1 高效液相色谱图：A.阴性样品；B.808猩红对照品；C.供试品
图2 紫外光谱图：A.对照品；B.供试品
2.4.2 808 猩红的LC-MS 方法确证流动相：乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵，梯度洗脱；流速0.2 mL/min；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温为35 ℃；进样量1 μL。离子源：ESI，正离子检测；检测模式：SIM；毛细管温度400 ℃，鞘气流速：600 L/h，电压：源3.6 KV，锥孔电压：25 V。采用ESI 正离子扫描模式，以m/z 368 为母离子，选择质荷比（m/z）368.3 →275.2 作为检测离子对。供试品中可提取到808 猩红一级、二级质谱图，与808 猩红对照品质谱图结果一致。质谱图见图3。
图3 色谱质谱图：A.808猩红对照品一级质谱图；B.供试品一级质谱图；C.808猩红对照品二级质谱图；D.供试品中808猩红二级质谱图
2.5 线性关系考察
精密吸取对照品储备液（0.072 mg/mL）1、3、5、7、10、20 μL，对照品溶液（7.2 μg/mL）1 μL 分别注入液相色谱仪，以进样量（μg）为横坐标，峰面积的值为纵坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=3 715 327.45X-47 103.20，r=0.999 9。结果表明：808 猩红对照品在0.007 2～1.440 0 μg 范围内线性关系良好。
2.6 检测限与定量限
按上述色谱条件将808 猩红对照品溶液稀释，进行测定。以信噪比（S/N）约为3 和10 时的进样量（ng）为检测限和定量限，结果当S/N=3 时检测限为2.8 ng；当S/N=10 时定量限为5.76 ng。
2.7 精密度试验
取对照品溶液按“2.1”项下的色谱方法，重复进样6 次，结果峰面积积分值的RSD 为1.10%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验
取同一批号柏子养心片样品（A 厂，批号：140605），平行制备6 份供试品溶液按“2.1”项下的色谱方法测定，结果808 猩红含量的RSD 为1.91%（n=6）。表明本方法重复性良好。
2.9 稳定性试验
取同一柏子养心片供试品溶液，在0、6、12、24 h 分别进样测定，记录808 猩红的峰面积，结果RSD 为0.42%（n=6）。表明24 h 内基本稳定。
2.10 加样回收率试验
精密称取柏子养心片样品（A 厂，批号：140605）约5 g，精密加入浓度为0.072 mg/mL 的对照品溶液0.6 mL，按照供试品溶液的制备方法，制成6 份供试品溶液。按“2.1”项下的色谱方法进行测定，结果平均回收率为97.86%，RSD=1.24%（n=6）。
2.11 样品测定
取不同厂家，不同批号柏子养心片样品12 批，按照“2.3”项下的方法制备样品溶液，按照“2.1”项下的色谱方法进行测定。结果12 批次样品中有2批次检出808 猩红，见表1。
表1 柏子养心片样品测定结果（n=3，μg/g）
3 讨论
3.1 样品提取条件考察
分别比较了70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇、丙酮五种试剂作为超声提取溶剂，结果以丙酮提取的含量最高。在此基础上，比较了加热回流、超声处理两种方法对提取的影响，结果两种方式提取的含量相当，故采用操作简便的超声提取方式。同时考察了20、30、60 min 三种提取时间对提取效率的影响，结果表明30 min 已提取完全，因此最终选择丙酮超声提取30 min 作为样品制备方法。
3.2 HPLC 色谱条件考察
分别考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液不同比例的流动相，考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱温以及0.8 mL/min、1.0 mL/min 流速，最终确定以乙腈-0.1%甲酸溶液（85∶15）为流动相；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min的分离效果最佳，色谱峰纯度较高，该HPLC 法可用于柏子养心片中808 猩红的含量测定。
3.3 液质联用方法
采用LC-MS 液质联用法，对HPLC 法检出808 猩红的阳性样品进行确证。采用ESI 正离子模式，以m/z 368 为母离子，选择质荷比（m/z）368.3 →275.2 作为检测离子对，可有效鉴别柏子养心片中非法着色剂808 猩红。
柏子养心片中药味较多，肉桂、党参、半夏曲和朱砂为原粉入药，引入的808 猩红可能来源于朱砂药材。根据样品检测结果，12 批次样品中有2 批次检出808 猩红，提示柏子养心片中的投料药材仍然存在非法染色现象，非法染色危害向制剂中转移现象不容忽视。监管部门应高度关注中药材及饮片质量，加强对药材质量的控制，有效防止药材中非法添加色素带入制剂中，确保人民群众用药安全。
