超高效液相色谱-串联质谱法测定乌骨鸡中23 种磺胺类药物残留

谢慧英，李娟，于晖，周鸿

江西省疾病预防控制中心，江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西 南昌 330029

乌鸡白凤丸具有补气养血和调经止带的功效，是治疗妇科疾病的“三大圣药”之一［1］，收载于《中国药典》2020 年版一部，其配方主要原材料为乌骨鸡，约占制剂用量的25%［2］，乌骨鸡的品质直接影响乌鸡白凤丸的药用功效。目前乌骨鸡主要以人工养殖为主，在养殖过程中常使用磺胺类药物抵御病虫害［3］，不合理用药会导致乌骨鸡存在药物残留［4］，并传递到人体，危害人体健康。因此，准确测定乌鸡白凤丸原料中乌骨鸡的药物残留，对乌鸡白凤丸的用药安全有着十分重要的意义。

传统磺胺类药物检测方法有液相色谱法和液相色谱串联质谱法等［5-7］，样品前处理过程相对繁琐、灵敏度不高、抗干扰能力差，难以满足23 种磺胺类药物同时测定的需要。药物残留前处理方法有液液萃取、固相萃取、加速溶剂萃取和分散固相萃取等方法［8-11］。其中分散固相萃取具有快速简便和高效可靠的特点，在磺胺类药物分析中已有相关报道［12-15］，而在乌骨鸡中药物残留分析报道较少。本实验以磺胺类药物为研究对象，采用碳纳米管结合分散固相萃取，建立了测定乌骨鸡中23 种磺胺类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱方法，以促进乌骨白凤丸药业的发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30A 超高压液相色谱仪（日本岛津公司）；Sciex QTRAP 5500 质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；高速低温离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；多孔涡旋振荡器（德国Heidolph 公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；电子天平（瑞士Metter Toledo）。

23 种磺胺混合标准溶液（100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司）；多壁碳纳米管（MWCNTs，南京吉仓纳米科技有限公司）；无水硫酸钠、C18 和PSA（天津博纳艾杰尔公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱级，美国Merck 公司）；乙酸铵（色谱级，上海阿拉丁公司）；乌骨鸡来源于商场、农贸市场和网店。

1.2 标准溶液的配制

移取适量的23 种磺胺类药物标准溶液，加入甲醇配制成5.0 mg/L 混合标准储备液，在-20 ℃保存；选取空白样品2.00 g，按“1.3”项下的方法制备空白基质提取液，用空白基质提取液逐级稀释混合标准储备液，配制成1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL 的基质匹配混合标准系列，于4 ℃保存。

1.3 样品溶液的制备

称取2.00 g 样品于50 mL 离心管中，加入1%（体积分数）甲酸的乙腈10 mL，涡旋振荡30 min，以8 000 r/min 于4 ℃离心10 min，取出4 mL 上清液，加入100 mg C18、50 mg PSA、20 mg MCNTs和500 mg 无水硫酸钠，涡旋1 min，以10 000 r/min于4 ℃离心10 min，吸取2 mL 上层清液，氮吹干至近干，加入1 mL 初始流动相，复溶，涡旋混匀1 min，过0.22 μm 滤膜，备用。

1.4 色谱与质谱条件

液相色谱条件：BEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样体积为2 μL；流速：0.3 mL/min。流动相A：含0.1%（v/v）甲酸的1 mmoL/L 乙酸铵水溶液，流动相B：甲醇。梯度洗脱程序:0～1.0 min,10% B；1.0～7.0 min，10% B～45% B；7.0～12.0 min，45% B～95% B；12～14 min，95% B；14.1～16 min，10% B。

质谱条件：离子源正离子模式（ESI+）；多反应监测；气帘气：35.0 L/h；雾化气：50.0 L/h;加热辅助气流量：50.0 L/h；离子喷雾电压：+5 500 V；离子源温度：500 ℃；其他质谱条件见表1。

表1 质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

本实验待测的磺胺类药物中，包含相同的母离子和子离子同分异构体，这些同分异构体需在色谱中分离，避免相互干扰。考虑待测化合物的保留时间、峰型和质谱响应等因素，选定含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol/L 乙酸铵水溶液-甲醇作为流动相体系。在该体系下，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧达嗪和磺胺间甲氧嘧啶，磺胺二甲异嘧啶和磺胺二甲嘧啶，磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺间二甲氧嘧啶，3 组同分异构体药物均实现了色谱分离。图1 为3 组同分异构体药物的色谱图。

图1 3组同分异构体的MRM色谱图

2.2 提取溶剂和净化条件的选择

由于乙腈沉淀蛋白的能力优于甲醇和丙酮等常用提取溶剂，选用乙腈为提取溶剂，并加入1%甲酸以提高磺胺类药物的提取效率［14］。由于乌骨鸡中含有大量蛋白质、色素和有机酸等物质，如果前处理净化过程中未除去这些干扰物，将影响目标物的定量分析，污染离子源。在样品中加入C18 可消除脂类的干扰，加入PSA 可除去有机酸和金属离子等干扰，加入MCNTs 可去除色素，本实验将三种材料混合使用以达到最佳净化效果。分别考察了不同比例组成的净化剂对23 种药物净化效果的影响。实验结果表明，选用100 mg C18、50 mg PSA 和20 mg MCNTs 为净化剂能达到净化目的。

2.3 基质效应、检出限、定量限及加标回收率

采用基质曲线标准溶液与溶剂标准溶液中磺胺类药物的响应百分比减去100 的差值来评价基质效应，结果为负值表现为基质抑制，反之，则表现为基质增强［15］。结果表明，大部分磺胺类药物表现为弱抑制基质效应，而磺胺吡啶和磺胺嘧啶的基质效应抑制较大，见表2。为了保证方法的准确性，在最佳实验条件下，制备空白基质匹配标准曲线以减少基质效应影响，图2 为空白基质中的23 种磺胺类药物的总离子流图。

表2 23种磺胺类药物的基质效应、相关系数、检出限、定量限、回收率与精密度

表2 （续）

23 种磺胺类药物在1.0～50 ng/mL 的线性范围内均有良好的线性关系，同时在空白样品中添加低水平23 种药物，分别以3 倍和10 倍信噪比对应的浓度来确定检出限和定量限。23 种磺胺类药物的检出限均≤0.58 μg/kg，定量限均≤1.91 μg/kg。

取50 ng/mL 的23 种磺胺类药物混合标准溶液进行精密度实验，进样6 次，比较定量离子峰面积，统计各种目标物峰面积，峰面积的RSD 为0.42%～5.2%。在空白样品中进行3 个水平（1.0、5.0和10 μg/kg）的加标回收实验，23 种药物平均加标回收率为74.8%～106.0%，RSD（n=6）为3.1%～9.8%。

2.4 实际样品测定

采用本实验方法对10 批次乌骨鸡样品进行监测，1 批次乌骨鸡检出磺胺甲氧嘧啶（0.96 μg/kg），但未超过国家限量标准（农业部235 公告），其余样品均未检出目标物。

3 结论

基于分散固相萃取技术，以酸化乙腈为提取剂，C18、PSA 和MCNTs 为混合净化剂，结合超高效液相色谱-串联质谱，建立了乌骨鸡中23 种磺胺类药物残留的分析方法。本方法操作简便、快速、高效，灵敏度高且成本低廉，通过方法学验证，准确性、重复性、检出限和定量限均能满足乌骨鸡中的23 种磺胺类药物残留分析要求。为乌骨鸡中药物残留监控提供技术支持，对进一步保障乌骨白凤丸药业质量安全具有现实意义。