超高效液相色谱-三重四级杆质谱法检测乌鸡白凤丸中鹿角胶特征肽及牛皮源成分

黄飞燕，李晓君，张国昌，李荣玮，黄晓燕

1.滇西科技师范学院，云南 临沧 677000；2.孟定海关综合技术中心，云南 临沧 677000；3.湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001

乌鸡白凤丸由乌鸡、白芍、鹿角胶等二十味药组成，作为治疗妇科类疾病的重要药物之一，主要功效主要有补气养血、调经止带，用于治疗气血两虚、腰膝酸软、崩漏带下等症［1］。《中国药典》2020 年版一部中对该药的质量标准进行了规定，其药用成分由乌鸡、白芍、鹿角胶等二十味药组成。药典中所记录的乌鸡白凤丸的质量标准中暂时没有无胶类原料成分的检测方法，而胶类原料因来源有限，制作工序复杂，价格一直居高不下。很多不法商家以掺伪、造假等获取不法暴利的问题十分突出，既损害了消费者的利益、影响其身心健康，也不同程度扰乱了含胶类药品市场。因此，要保障消费者的切身利益，就必须确保含胶类药品的质量。作为主要药用成分之一，胶类由何种动物皮熬制而成和含量的多少是影响药效、药价成本的重要指标。为了准确评价市售乌鸡白凤丸的质量标准，建立一套检测乌鸡白凤丸中胶类成分来源及成分含量的标准，实现对胶类成分的专属性和可控性检测评价，符合现实需求、十分必要且意义重大。

为了保证含鹿角胶类药品的质量及提高检测的专属性，国家先后出台了鹿角胶原料的鉴别［2］及补充检验方法［3-5］，但对于市售乌鸡白凤丸中是否添加鹿角胶成分，添加的含量为多少，现有能查到和借鉴的文献较少，为补充完善乌鸡白凤丸中鹿角胶成分专属性检测方法，本研究在参考鹿角胶测定及牛皮源检测的有关文献［6-11］的基础上，随机采集市售2 个厂家5 批次的乌鸡白凤丸样品，运用超高效液相色谱-三重四级杆质谱（UPLC-QQQ/MS）分析检测技术，以鹿角胶特征肽为标志物进行定性和定量分析检测，分析测定了样品中的鹿角胶特征肽及牛皮源成分，该检测方法可为含鹿角胶类药品的质量控制及药品监管提供技术参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

分析天平（梅特勒-托利多XSE 205）；超声波清洗器（新芝SBL-30DT）；液相色谱质谱联用仪（戴安Ultimate 3000-TSQ）。

1.2 试药

对照药材：黄明胶（批号121695-201802）、鹿角胶（批号121694-201702），购自中国食品药品检定研究院。市售乌鸡白凤丸样品随机购买自某药房（厂家A，批号20201070、20201266、20 201075；厂家B，批号20200801、20200802）；阴性样品按处方自行制备。胰蛋白酶（质谱级），乙腈（色谱纯），水（超纯水），其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters UPLC BEH C18（2.1 mm ×75 mm，1.7 μm），样品进样体积：5 μL，色谱柱柱温：30 ℃；流动相组成：乙腈（A），0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脱条件：0～6 min，5%→7% A，6～8 min，7%→90%A，8～15 min，90% A，15～20 min，90%→5% A，流速：0.3 mL/min。

2.2 质谱条件

采用ESI+模式进行数据采集，毛细管电压设定为3 100 V，离子源温度设定为100 ℃，在350 ℃下进行去溶剂化，鞘气流速600 L/h，以MRM 模式进行扫描。设定鹿角胶特征分子离子峰m/z 765.4（双电荷）→554.0、733.0，黄明胶特征分子离子峰m/z 641.3（双电荷）→726.2、783.3 为检测离子对，碰撞能量分别为16 V 和20 V，按上述检测离子对测定的MRM 色谱峰的信噪比均应大于3∶1。

2.3 供试品溶液的制备

取乌鸡白凤丸原药约2 g（相当于含鹿角胶约0.1 g），精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氢铵溶液45 mL，置于超声波仪中超声提取30 min，中间间隔10 min，重复提取2 次，超声完成后补加1%碳酸氢铵溶液定容至刻度线，充分摇匀后经0.22 μm 的微孔滤膜过滤，移取其中滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（配制方法：取质谱级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成浓度为1 mg/mL 的溶液，使用时配制），混合均匀后置于37 ℃下恒温酶解12 h，由此制得供试品溶液。

2.4 鹿角胶对照药材溶液的制备

取鹿角胶对照药材粉末0.1 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，按照“2.3”项所列方法制成对照药材溶液。

2.5 牛皮源成分参比溶液的制备

取黄明胶对照药材0.1 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氢铵溶液45 mL，超声提取60 min，补加1%碳酸氢铵溶液至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5 mL 转移至50 mL 容量瓶中，用“2.4”项下鹿角胶对照溶液稀释至刻度，按照“2.3”项所列方法制成牛皮源参比溶液。

2.6 阴性样品溶液制备

根据2020 年版《中国药典》2020 年版描述的乌鸡白凤丸处方组成，按比例准确称取不含鹿角胶的阴性样品，依照“2.3”项制备方法制成阴性样品溶液。

2.7 鹿角胶鉴别的方法学考察

2.7.1 专属性试验精密吸取鹿角胶对照药材溶液、阴性样品对照溶液和供试品溶液（厂家B，批号20200801）各5 μL，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，以鹿角胶特征分子离子峰m/z 765.4（双电荷）→554.0、733.0 作为检测离子对通过进行分析测定。比较供试品鹿角胶特征色谱峰保留时间（7.86 min、7.87 min）和对照药材品鹿角胶特征色谱峰保留时间（7.85 min、7.87 min）得出二者保留时间一致，而阴性样品在相同保留时间位置没有出现相应色谱峰，由此可以表明其他药材成分对测定结果无干扰，从而证明该检测方法专属性强，相关图谱结果见图1。

图1 不同溶液中鹿角胶特征离子色谱图：A.对照药材溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液

2.7.2 稳定性试验采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，依次对配制后0 h、6 h、12 h、24 h 相同批号供试品（厂家B，批号20200801）进行分析测定。根据鹿角胶特征分子离子峰m/z 765.4（双电荷）→554.0 提取的供试品离子流色谱中，放置不同时间的供试品中鹿角胶特征色谱峰峰面积的RSD 为5.8%，由此可判断供试品在配制后24 h 内基本稳定。

2.7.3 重复性试验取相同批号（厂家B，批号20200801）乌鸡白凤丸样品6 份，按照“2.3”项所列方法分别制备供试品溶液并依次进行分析测定，结果显示6 份供试品在相同保留时间（7.85 min、7.87 min）均出现了与对照品药材相应的鹿角胶特征色谱峰，由此可知供试品满足重复性实验。

2.7.4 检出限将制备好的鹿角胶对照药材溶液，用乌鸡白凤丸阴性样品溶液依次逐级稀释，以鹿角胶特征分子离子峰m/z 765.4（双电荷）→554.0 作为检测离子对，按照信噪比为3∶1 计算检出限，求得鹿角胶最低检出浓度约为0.02 mg/mL。

2.8 牛皮源成分检查的方法学考察

2.8.1 专属性试验精密吸取黄明胶参比溶液、阴性对照样品溶液和供试品溶液（厂家B，批号20200801）各5 μL，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，以牛皮源特征离子对m/z 641.3（双电荷）→726.2、783.3 作为检测离子对进行分析测定。把供试品和阴性对照样品溶液色谱图与参比溶液色谱图进行对比，发现供试品和阴性对照样品溶液色谱图中在保留时间8.24 min 处没有出现与参比溶液黄明胶特征色谱保留时间（8.24 min）相同的色谱峰。由此表明处方中其他药材成分对测定结果无干扰，证明该方法专属性强，相关图谱结果见图2。

图2 不同溶液中牛皮源特征离子色谱图：A.参比溶液；B.样品溶液；C.阴性对照样品溶液

2.8.2 线性关系准确称取黄明胶对照药材约0.4 g，放置于200 mL 容量瓶中，加入160 mL 1%碳酸氢铵溶液，经超声波处理60 min，补加1%碳酸氢铵溶液至刻度，充分摇匀备用。分别精密吸取上述黄明胶溶液2.5、5、10、15、25 mL，置于编号为1-5 号50 mL 量瓶中，准确称量5 份鹿角胶对照药材0.1 g，分别加入5 个容量瓶中，再分别加入适量1%碳酸氢铵溶液，超声处理60 min 使溶解，补加1%碳酸氢铵溶液至刻度，充分摇匀备用，由此制得分别含0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/mL 黄明胶的不同浓度溶液（约相当于鹿角胶对照药材样品中掺入质量比为5%、10%、20%、30%、50%的黄明胶），按照相同的方法进行分析测定。以黄明胶特征色谱峰峰面积数值为纵坐标，以掺入黄明胶的量为横坐标绘制标准曲线，黄明胶特征分子离子峰m/z 641.3（双电荷）→726.2 检测离子对的回归方程：Y=1.06×105X+41 586，r=0.995 3，由此得出含黄明胶溶液在0.1～1.0 mg/mL 浓度范围内，满足良好的线性关系。

2.8.3 精密度试验准确吸取黄明胶牛皮源参比溶液5 μL，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，以m/z 641.3（双电荷）→726.2 作为检测离子测定峰面积，平行测定6 次，其峰面积的RSD 为1.5%，表明仪器的精密度良好。

2.8.4 稳定性试验采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，依次对配制后的0 h、6 h、12 h、24 h 黄明胶参比溶液进行依法测定。以m/z 641.3（双电荷）→726.2 作为检测离子分别测定不同时间的黄明胶参比溶液特征峰峰面积，放置不同时间的黄明胶参比溶液特征峰峰面积的RSD 为2.2%，由此可判断黄明胶参比溶液在配制后24 h 内基本稳定。

2.8.5 重复性试验取相同批号（厂家B，批号20200801）乌鸡白凤丸样品6 份，按照“2.3”项所列方法分别制备供试品溶液并依次进行分析测定，6 份供试品均出现与溶液在参比溶液色谱相应的色谱出峰位置出现了相应的色谱响应，计算6 份样品峰面积值RSD 为4.5%，由此可知供试品满足重复性实验。

2.8.6 检出限将制备好的黄明胶对照药材溶液依次逐级稀释，以黄明胶特征分子离子峰m/z 641.3（双电荷）→726.2 作为检测离子对，按照信噪比为3∶1 计算检出限，求得黄明胶最低检出浓度约为0.01 mg/mL。

2.9 样品测定结果

按照“2.3”项下方法，分别将采集的2 个生产厂家的5 个批次乌鸡白凤丸样品制成供试品溶液，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，分别对其中鹿角胶及牛皮源成分进行分析测定。结果显示2个生产厂家的5 个批次乌鸡白凤丸样品中均检出鹿角胶特征肽，5 个批次乌鸡白凤丸样品均检出牛皮源成分，但因样品中牛皮源成分特征峰峰面积均低于参比溶液峰面积，可视为未检出。

3 讨论

3.1 限度的拟定

在实验过程中，为排除在样品制取过程中因客观原因混入少量牛皮源的情况，需要对牛皮源成分的检出比例进行合理规定。按照2020 年版《中国药典》2020 年版第四部中“附录0212 药材和饮片检定通则”、国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（编号2012001、2014013、2014014）中的有关规定，结合实际需要，可以将乌鸡白凤丸中牛皮源成分检查的限度设定为5%，即检测结果中如果牛皮源成分特征峰峰面积与参比溶液峰面积差比值小于或等于5%，由此可判定为检测的样品中不存在牛皮源掺伪，反之，则判定检测的样品中存在牛皮源掺伪。

3.2 牛皮源测定结果的判定

对于牛皮源测定结果的影响因素，可以从仪器的生产厂家、型号、仪器的灵敏度等方面的差异来考虑，特别是当测试样品中牛皮源成分含量恰好处于仪器检测限附近时，检测结果就没有实际比较意义。因此，在实际分析测定时，需要把供试品的测定结果与参比溶液测定结果进行比较分析，从而确保结果判定的科学性。综合测定结果可以参照下列3 种情况进行判定：（1）供试品色谱图中未出现参比溶液牛皮源特征色谱峰，判定供试品中未检出牛皮源成分；（2）供试品色谱图中出现参比溶液牛皮源特征色谱峰，但经过比较，二者峰面积差比值不超过5%，判定供试品中未检出牛皮源成分；（3）供试品色谱图中出现参比溶液牛皮源特征色谱峰，且其峰面积值与参比溶液峰面积差比值大于5%，判定供试品中检出牛皮源成分。

3.3 样品质量分析

按照设定的分析方法，通对本品的检测结果显示，采集的2 个厂家5 批次的乌鸡白凤丸5 批样品均检出鹿角胶且未检出牛皮源成分。由此说明采集的上述5 批次的乌鸡白凤丸均符合国家药品标准，不存在鹿角胶掺伪投料的情况。

3.4 检测方法分析

本研究采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱，选择鹿角胶特征肽特征分子离子峰m/z 765.4（双电荷）→ 554.0、733.0 及牛皮源特征分子离子峰m/z 641.3（双电荷）→726.2、783.3 作为检测离子对，对经胰蛋白酶酶解处理后的乌鸡白凤丸供试品进行定性、定量分析测定，再通过计算和对比分析，判定乌鸡白凤丸中是否存在鹿角胶特征肽和牛皮源成分。所建立的分析检测方法专属性强，分析结果准确、可靠，能同时快速有效鉴别鹿角胶特征肽和牛皮源成分，对有效控制和监管含鹿角胶药材制剂的质量提供了参考。