龙胆泻肝丸中木通的鉴别研究

周云峰，谢婷，邓杰华，李存金，杨建冬，黄炳泉

1.宜春市检验检测中心，江西 宜春 336000；2.宜春市人民医院，江西 宜春 336000；3.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330000

龙胆泻肝丸（水丸）的原处方含有关木通，收载于《中国药典》2000 年版一部［1］，由于龙胆泻肝丸肾毒性事件［2］，2003 年国家药品监督管理局取消了关木通（含马兜铃酸）的药用标准，并责令把龙胆泻肝丸处方中的关木通更换为木通（木通科），现收录于《中国药典》2020 年版一部［3］。然而，现行药典标准没有对龙胆泻肝丸方中木通的质量进行控制，难以知悉木通投料的真实情况，加上市场仍存在关木通、川木通等混淆作木通使用的情况［4-7］，这可能会对含有木通药味的中药复方制剂的质量带来较大风险。基于此，为了有效保证龙胆泻肝丸安全、有效、质量可控，本研究采用超高液相串联质谱技术建立龙胆泻肝丸中木通的定性鉴别方法，为提升龙胆泻肝丸的质量标准、进一步控制制剂的整体质量提供实验参考和技术支撑。

1 仪器与试药

超高液相色谱-质谱联用仪（美国waters 公司，液相仪型号：H-class，质谱仪型号：xevo TQD）；MS205DU 电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；TLE 204E 万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PL-S60 超声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）。

龙胆泻肝丸（共抽取市售产品36 批，均为水丸，涉及17 个生产厂家，36 个批号，4 个规格：每100粒重6 g、每袋装6 g、60 g/瓶、每袋装3 g）；木通对照药材（批号：201101，来源于湖南省松龄堂中药饮片有限公司，由本中心杨建冬主任中药师鉴定）；川木通对照药材（批号：121409-202003，中国食品药品检定研究院）；关木通对照药材（批号：DST201219-072，成都德思特生物技术有限公司）；甘木通对照药材（批号：121443-201102，中国食品药品检定研究院）；木通苯乙醇苷B 对照品（批号：111910-201604，纯度98.2%，中国食品药品检定研究院）；乙腈（质谱级，德国默克股份两合公司）；甲酸（质谱级，赛默飞世尔科技有限公司）；甲醇（色谱级，西格玛奥德里奇贸易有限公司）；水（蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

2 方法与结果

2.1 检测条件

液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，流动相乙腈A 和0.1%甲酸溶液B（梯度洗脱程序：0～13 min，90%～25% B；13～15min，25% B；15.01～17 min，90% B），流速0.2 mL/min，进样量2 μL，柱温30 ℃；质谱条件：电喷雾离子源（ESI-），温度150 ℃，子离子扫描模式，母离子m/z 477［M-H］-，扫描范围60～600 m/z，质谱采集数据时间0～10 min，毛细管电压0.5 kV，锥孔电压-55 V，碰撞电压30 V，锥孔气流量50 L/h，脱溶剂气流量900 L/h，脱溶剂气温度550 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液精密称取木通苯乙醇苷B 对照品适量，加70%甲醇溶液溶解稀释成约0.5 μg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液样品研细，取约1 g，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加入70%甲醇溶液约80 mL，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）60 min，放冷，加70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照药材溶液取木通、川木通、甘木通和关木通对照药材各0.1 g，精密称定，分别按“2.2.2”项下供试品溶液的处理方法制备对照药材溶液。

2.2.4 阴性样品溶液方中各药味均以原粉入药，按照处方比例，制备缺木通药味的龙胆泻肝丸阴性样品粉末，取约1 g，精密称定，再按“2.2.2”项下供试品溶液的处理方法制备阴性样品溶液。

2.3 专属性

取阴性样品溶液、对照药材溶液、木通苯乙醇苷B 对照品溶液和供试品溶液各2 μL，按2.1项下检测条件依次进行测定，子离子扫描的总离子流图（TIC）见图1。结果表明，市售样品溶液的一级质谱出现与木通苯乙醇苷B 对照品溶液、木通对照药材溶液保留时间一致的色谱峰，而阴性样品溶液、川木通对照药材溶液、关木通对照药材溶液和甘木通对照药材溶液均未检出与木通苯乙醇苷B 对照品溶液保留时间一致的色谱峰，说明阴性样品溶液对检测无干扰，且川木通、关木通和甘木通不含有木通的特征性成分木通苯乙醇苷B，专属性良好。

图1 各溶液EIC提取离子流图：A.阴性样品；B.川木通；C.关木通；D.甘木通；E.木通；F.木通苯乙醇苷B对照品；G.供试品

2.4 样品结果

取36 批水丸样品，制成供试品溶液后，按“2.1”项下检测条件测定。结果可知，所有样品的一级质谱均检出与木通苯乙醇苷B 对照品溶液保留时间一致的色谱峰，且样品的二级质谱的主要碎片离子为315、281、179、161、135、119 和89，与木通苯乙醇苷B 对照品和木通对照药材的主要碎片离子一致，说明所抽取的龙胆泻肝丸样品均含有木通苯乙醇苷B 成分。

3 讨论

液相色谱串联质谱法具有分析速度快、灵敏度高、选择性好、专属性强等特点，被广泛用于药品非法添加成分检查及中药复方制剂中药味的定性和定量分析［8-13］。木通苯乙醇苷B 是木通的特征性定量成分［3,14-15］，本研究尝试采用液质联用技术对其进行快速鉴别分析，采用了子离子扫描检测模式，同时采用正、负离子切换模式测试，发现采用负离子模式，木通苯乙醇苷B 具有较高的质谱响应。

方法的耐用性试验，主要对不同色谱柱、不同温度和不同流速进行了考察。色谱柱使用了Waters 公司的Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱和Waters ACQUITY UPLC CSH C18 柱；温度设定了25 ℃、30 ℃和35 ℃三个温度；流速测试了三种（0.2 mL/min、0.25 mL/min 和0.3 mL/min）。结果显示不同色谱柱、不同温度和不同流速对测定结果无影响，只会影响目标化合物的出峰时间。

水丸样品处方中各药味均以原粉入药，木通投料占比量约为7.1%，称取1.0 g 左右的样品约相当于0.1 g 的木通原料。为了考察川木通、关木通和甘木通中是否含有木通的特征性化学成分木通苯乙醇苷B，川木通、关木通和甘木通对照药材各称取约0.1 g，以水丸样品相同的处理方法制备对照药材溶液进行测定比较，结果显示川木通、关木通和甘木通对照药材均未检出木通苯乙醇苷B，而市售样品和木通对照药材均可检出，说明所建方法能够对样品中木通进行准确定性分析，可有效甄别是否有混淆品冒充替代木通进行投料，可作为龙胆泻肝丸中木通质量的控制方法。