基于UPLC-Q-TOF-MS分析下瘀血汤活性成分及其抗肝癌作用机制网络药理学研究

邓哲，欧阳昭广，龙红萍，唐玲，朱文豪，孟繁颖，周思倩，怀家轩，田雪飞

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南中医药大学方证转化湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；2.广州医科大学附属口腔医院，广东 广州 510182；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208

原发性肝癌发病隐匿、侵袭及转移性强、病程进展迅速、预后差。中医药治疗肝癌具备一定优势，研究显示血瘀证是原发性肝癌最常见的基本证候。肝癌患者常出现胁腹部胀痛结块、刺痛不移，舌质黯红、有瘀斑瘀点，舌下脉络瘀曲，脉涩等。国医大师周仲瑛认为，血瘀是肝癌发病的重要病机，贯穿肝癌病程始终，也是促使癌毒形成的关键病理因素。下瘀血汤出自《金匮要略》，由大黄、桃仁、土鳖虫组成，用于治疗女子产后瘀血内停致少腹疼痛。国医大师周岱翰将其用于辨治消化系统肿瘤，认为治疗肝癌应以活血化瘀为主，选方以下瘀血汤为先。近年研究表明，下瘀血汤可抑制肝癌细胞增殖，促进其凋亡，且可辅助经动脉化疗栓塞（TACE）治疗原发性肝癌。目前对于下瘀血汤的活性成分及其治疗原发性肝癌作用机制尚未明确。本研究应用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）对下瘀血汤的成分进行分析鉴定，结合网络药理学及分子对接探究下瘀血汤主要活性成分的作用靶点及信号通路，阐明其抗肝癌作用机制，并运用体外细胞实验进行验证，为下瘀血汤的深入研究与临床应用提供参考。

1 材料

1.1 药物与细胞

下瘀血汤配方颗粒（按《金匮要略》原方配比，大黄∶桃仁∶土鳖虫＝5∶1∶2，批号分别为1016935、1071233、1036473），广东一方制药有限公司。肝癌细胞HepG2和Huh-7细胞株，中国浙江美森细胞科技有限公司。

1.2 主要仪器与试剂

Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色谱-质谱联用仪（配置MassHunter 质谱工作站），美国Agilent 公司；Biofuge primoR 台式离心机，美国Thermo公司；Milli-Q超纯水制备仪，美国Millipore公司；XS105电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司。mRNA提取试剂盒（货号DP501），北京天根生化科技有限公司；mRNA 反转录试剂盒（货号E047-01B），苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；胰蛋白酶（货号CTCC-002-006）、DMEM 高糖培养基（货号CTCC-002-008）、胎牛血清（货号CTCC-002-001）、抗生素（货号15240112），中国赛默飞世尔科技有限公司；色谱纯乙腈、甲酸，自制超纯水。

2 方法

2.1 下瘀血汤成分分析

2.1.1 供试品溶液制备

精密称取下瘀血汤配方颗粒2.0 g，置50 mL锥形瓶中，分别加50%、70%、100%甲醇溶液30 mL，超声溶解30 min，静置后取2 mL溶液，室温、8 000 r/min离心5 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，得样品1 mL，置进样瓶中，进样分析。

2.1.2 色谱条件

Agilent Extend C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相A为水（含0.1%甲酸）、B为乙腈，梯度洗脱（见表1），流速0.4 mL/min，进样量1 μL。

表1 下瘀血汤成分测定流动相梯度洗脱程序（%）

2.1.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；准确质量数用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）校正，采用正负离子分析模式，MRE扫描方式。一级扫描范围：m/z 100～1 500；除溶剂气为氮气；干燥气温度325 ℃，体积流量6.8 L/min；鞘气温度350 ℃；毛细管电压4.0 kV；Fragment电压110 V。二级质谱Fragment电压：10、20、40 kV；扫描范围：m/z 100～1 000。

2.2 下瘀血汤成分潜在作用靶点收集

基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析得到的下瘀血汤化学成分信息，采用TCMSP（https://tcmsp-e.com/）进行成分查询及靶点收集。对于TCMSP未收录成分，应用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查询SMILES号，再使用SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点补充，选择评分高的靶点。利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点全称转化为基因简称。

2.3 成分-靶点-疾病网络构建

以“primarylivercancer”为关键词，检索GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）数据库，查找相应靶点，去掉假阳性和重复靶点后，建立原发性肝癌靶点数据集。通过R语言软件（https://www.r-project.org/）将下瘀血汤活性成分靶点和原发性肝癌靶点进行匹配，获得下瘀血汤抗肝癌潜在靶点。采用Cytoscape3.8.2 软件（https://cytoscape.org/）构建下瘀血汤抗肝癌成分-靶点-疾病网络。

2.4 蛋白相互作用网络构建

将潜在靶点输入STRING数据库（https://string-db.org/），设置物种为“Homo sapiens”，得到蛋白相互作用（PPI）关系，结果以TSV格式导出，应用R语言软件计算靶点互作频次，并绘制柱状图。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

将下瘀血汤抗肝癌靶点导入Metascape 数据库（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），设置物种为“Homo sapiens”，进行GO功能及KEGG通路富集分析。

2.6 分子对接

通过UniProt、PDB 数据库下载核心靶点蛋白CASP3、ESR1、MYC、PPARG的3D结构，使用PyMOL软件进行蛋白修饰，去除水分子与小分子配体，保存为pdb格式。在PubChem数据库中查询下瘀血汤主要活性成分的2D结构，采用Chem3D软件对各成分结构进行优化。采用AutoDock Vina软件对活性成分与核心靶点蛋白进行分子对接，用结合能评价二者的结合能力。选取结合能较好的2个活性成分，借助PyMOL软件将对接结果进行可视化绘图。

2.7 实验验证

2.7.1 动物

SPF级SD大鼠20只，体质量270～300 g，雌雄各半，6～8周龄，购自湖南斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号ZS-202107050003，动物伦理编号LLBH-202106090001。饲养于湖南中医药大学实验动物中心屏障级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度50%～80%，12 h/12 h光暗循环，普通饮食，适应性饲养1周后开始实验。本实验经湖南中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审核批准。

2.7.2 血浆样品制备

将大鼠随机分为下瘀血汤含药血清组和空白血清组，每组10只。下瘀血汤（大黄7.5 g，桃仁1.5 g，土鳖虫3.0 g）换算成配方颗粒为2.0 g/剂，按临床等效剂量的5倍给药。下瘀血汤含药血清组大鼠予0.18 g/d下瘀血汤灌胃，灌胃体积10 mL/kg。空白血清组予等量生理盐水灌胃。每日2 次，连续5 d。取材前禁食12 h，末次给药1 h后，3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，无菌条件下腹主动脉采血，常温静置，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上清液，过滤，-80 ℃保存备用。

2.7.3 CCK8法测定细胞增殖

将 HepG2 和 Huh-7 细胞以 1×10个/mL 接种于 96孔板，每孔100 μL，细胞培养24 h后，加入不同浓度含药血清配制的细胞培养液，设置空白组、对照组及2.5%、5%、10%、15%、20%含药血清组，每组6个复孔，加入相应含药血清培养24 h，每孔加CCK8溶液10 μL（1/10培养基量），1 h后于酶标仪450 nm处测定吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率[（对照组OD值－给药组OD值）÷（对照组OD值－空白组OD值）×100%]。

2.7.4 RT-qPCR检测

将对数生长期HepG2和Huh-7细胞以2×10个/mL接种于6孔板，每孔2 mL，设置对照组、实验组，每组设3个复孔，于37 ℃、5%CO、饱和湿度培养箱中培养24 h，分别加入空白血清和20%下瘀血汤含药血清培养48 h。提取总RNA并进行反转录，然后进行定量扩增。PCR反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃15 s、60 ℃ 30 s，40个循环。引物序列见表2。采用2法计算基因表达量。

表2 各基因PCR引物序列

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 下瘀血汤活性成分

下瘀血汤UPLC-ESI-Q-TOF-MS正负离子流图见图 1。运用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 工作站中的分子特征提取（MFE）功能，根据化合物的相对分子质量、质谱碎片离子信息，结合文献[19-21]对成分进行鉴定。鉴定出下瘀血汤49个活性成分，其中大黄28个、桃仁17个、土鳖虫4个。见表3。

图1 下瘀血汤UPLC-ESI-Q-TOF-MS正负离子流图

表3 下瘀血汤成分鉴定和归属

3.2 成分-靶点-疾病网络分析

通过GeneCards、OMIM数据库共获取原发性肝癌相关靶点15 711个。应用R语言软件将下瘀血汤活性成分靶点与肝癌相关靶点进行匹配，两者取交集后获得下瘀血汤抗肝癌潜在靶点63个。利用Cytoscape 3.8.2得到下瘀血汤抗肝癌成分-靶点-疾病网络，见图2。该网络有82个节点、193条边，平均度值4.7。预测得到下瘀血汤抗肝癌有效活性成分17个，其中大黄素甲醚、大黄素、亚油酸、棕榈酸、芦荟大黄素、山柰酚、没食子酸、腺苷、尿嘧啶的度值＞5，度值≥2的成分占88.23%；交集靶点共63个，其度值≥2，其中NCOA2、PTGS1、GABRA1、F7、CASP3的度值≥5，度值≥3的靶点占30.15%。

图2 下瘀血汤抗肝癌成分-靶点-疾病网络

3.3 蛋白相互作用网络分析

利用STRING数据库得到下瘀血汤抗肝癌潜在靶点PPI网络，结果见图3。该网络共63个节点、250条边，平均度值7.98。由于靶点DIO1、SLC7A7、PRSS1、SLC22A5、F7 未参与PPI 网络，故予剔除。其中度值≥3的靶点占76.19%，度值＞10的靶点主要有CASP3、ESR1、PPARG、MYC、RELA、CYP1A1、MAPK8、 PGR、 AR、 CYP3A4、 GSTP1、 AHR、CYP1B1、 ICAM1、 IKBKB、 CCNB1、 GSTM1、NCOA1、SLC2A4等，将其作为下瘀血汤抗肝癌核心靶点，30个核心靶点见图4。相互作用频次较高的靶点有CASP3、ESR1、PPARG、MYC，表明下瘀血汤活性成分与其有较高的结合活性，提示这些靶点可能是下瘀血汤抗肝癌的关键靶点。

图3 下瘀血汤抗肝癌靶点PPI网络

图4 基于PPI网络拓扑分析的下瘀血汤抗肝癌核心靶点

3.4 GO功能分析

对核心靶点进行GO功能分析，从生物过程、细胞组分和分子功能三方面进行基因功能注释，＜0.01的前20个条目见图5。结果显示，核心靶点分子功能主要涉及氧化还原酶活性、核受体反应、谷胱甘肽转移酶活性、脂质结合、激酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、整合素结合等；生物过程主要涉及激素反应、缺氧反应、化学应激的细胞反应、激素水平的调节、节律过程、细胞死亡的正向调节、炎症反应、雌二醇反应、细胞内受体信号通路、细胞增殖的负调控、循环系统过程、上皮细胞增殖调节等；细胞组分主要涉及膜筏、复杂的转录调节因子、复杂受体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞外基质、线粒体外膜等。

图5 下瘀血汤抗肝癌潜在靶点GO富集分析

3.5 KEGG通路富集分析

对核心靶点进行KEGG通路富集分析，选取＜0.01的信号通路进行可视化，见图6。与肝癌发病相关的机制主要涉及化学致癌作用-受体活化、癌症通路、乙型肝炎、鞘脂信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症的MicroRNAs、AMPK信号通路、cGMP-PKG信号通路、紧密连接蛋白等。

图6 下瘀血汤抗肝癌潜在靶点KEGG通路富集分析

3.6 分子对接结果

将下瘀血汤抗肝癌17个活性成分与4个关键靶点（CASP3、ESR1、MYC、PPARG）进行分子对接分析，结果见表4。结合能越小表示该活性成分与靶点蛋白的亲和力越高，结合能＜-5.0 kcal/mol表明成分与靶点亲和活性较强。分子对接结果显示，大部分活性成分与靶点结合能＜-5.0 kcal/mol，表明下瘀血汤活性成分与4个关键靶点具有较好的亲和力，其中儿茶素二聚体、大黄酚葡萄糖苷与CASP3、ESR1、MYC、PPARG的结合能＜-6.0 kcal/mol，且结合体构象较稳定，分子对接模式见图7。

表4 下瘀血汤主要活性成分与核心靶点分子对接结合能（kcal/mol）

图7 Procyanidin B1、Chrysophanol glucoside与关键靶点分子对接模式

3.7 下瘀血汤含药血清对肝癌细胞增殖的影响

不同浓度（2.5%、5%、10%、15%、20%）下瘀血汤含药血清作用于HepG2和Huh-7细胞12 h后，与对照组比较，血清浓度在10%开始对细胞增殖有抑制作用，细胞增殖抑制率随血清浓度升高而增加，在含药血清浓度为20%时抑制效果最佳（＜0.01），并可抑制靶点CASP3、ESR1、PPARG、MYC 表达（＜0.01）。见图8、图9。

图8 不同浓度下瘀血汤含药血清的肝癌细胞增殖抑制率（，n＝6）

图9 下瘀血汤含药血清对关键靶点表达的抑制作用（，n＝3）

4 讨论

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其高发病率、高死亡率、高恶性程度，以及临床治疗手段的缺乏，使探寻肝癌治疗的新药物、新靶点尤为迫切。肝癌与多种因素相关：持续肝炎病毒感染、长期酒精摄取、长时间接触致癌剂黄曲霉素等，糖尿病、肥胖等代谢疾病也是诱发肝癌的危险因素。大多数肝癌由慢性炎症发展而来，病程通常由慢性肝病发展成肝纤维化，再到肝硬化，最后恶化形成肝癌。中医认为，肝纤维化-肝硬化-肝癌的病程是瘀血逐渐聚集形成毒结的表现。肝癌病机多为情志抑郁，气机阻滞，血行不畅，导致气滞血瘀；或由湿热邪毒，或虫蛊、酒毒为害日久，瘀血毒结聚于肝脏。“肝藏血”的生理特性决定其病理状态下易肝血瘀阻，故血瘀贯穿病程始终，其肝纤维化-肝硬化-肝癌的过程也佐证“血瘀”病机。国医大师周岱翰认为，肝癌病机不外肝气郁结，气滞血瘀，壅塞脉络，无论初病、久病，活血化瘀是最常用之法，治疗多以下瘀血汤为主方加减。下瘀血汤为《金匮要略》为妇人产后瘀血内停致少腹疼痛而设，“产妇腹痛，法当以枳实芍药散，假令不愈者，此为腹中有干血著脐下，宜下瘀血汤主之；亦主经水不利”。方中大黄入血分，逐瘀荡热，推陈致新；桃仁活血化瘀，且有润燥之功；土鳖虫善开血闭，可攻干血，逐瘀破结。三药合用，破血之功峻猛。因下瘀血汤有活血逐瘀、攻坚破积之长，故凡瘀血内行、瘀阻经络之证均可因证施治，现代医家将其辨证用于肝癌治疗。现代研究显示了下瘀血汤治疗肝癌的有效性。如王曜等研究显示，用下瘀血汤加减治疗原发性肝癌肝热血瘀证TACE术后患者，可有效改善患者的肝功能和生活质量，并减轻化疗毒副反应。张浩等通过体内外实验研究表明，下瘀血汤可有效抑制肝癌细胞与裸鼠皮下移植瘤的增殖，促进肝癌细胞凋亡。

本研究应用UPLC-ESI-Q-TOF-MS结合网络药理学明确下瘀血汤的有效成分，预测下瘀血汤抗肝癌的作用机制，并通过体外实验进行验证。UPLC-ESI-QTOF-MS鉴定出下瘀血汤49个化学成分，其中大黄28个、桃仁17个、土鳖虫4个。成分-靶点-疾病网络显示，大黄中的没食子酸、芦荟苷、山柰酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酚葡萄糖苷，桃仁中的柠檬苦素、苦杏仁苷、儿茶素、棕榈酸、β-谷甾醇乙酸酯、亚油酸，土鳖虫中的腺苷、尿嘧啶为下瘀血汤潜在抗肝癌核心成分。山柰酚治疗肝病-肝纤维化-肝癌前景良好，可通过多种抗氧化和抗凋亡机制保护肝实质细胞，降低肝脏微环境中的免疫炎症反应，防止细胞凋亡，还可抑制内质网应激反应，抑制炎症和肿瘤生长。儿茶素、苦杏仁苷对肝癌细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用。芦荟大黄素可有效抑制肝癌细胞的增殖与迁移，其机制与Src/STAT3信号通路相关。大黄素具有抑制肝癌细胞增殖、侵袭、转移，促进凋亡，抑制肿瘤微环境血管新生等多重作用。大黄素甲醚可通过AMPK/Sp1/DNMT1信号通路上调miR-370诱导肝癌细胞凋亡。没食子酸可通过抑癌基因p53抑制人肝癌细胞增殖，诱导凋亡。棕榈酸可调节癌细胞膜流动性和葡萄糖代谢，发挥抑制肝细胞癌进展的作用。上述研究提示，下瘀血汤可能通过山柰酚、儿茶素、苦杏仁苷、芦荟大黄素、大黄素等活性成分发挥抗肝癌作用。

核心靶点GO 和KEGG 通路富集分析结果中，PI3K-Akt是经典的炎症信号通路，乙型肝炎是诱发肝癌的常见病因。肝癌具有男性多于女性的性别差异，激素水平可能是导致性别差异的关键因素。激活AMPK信号通路可通过抑制脂质代谢抑制肝癌细胞增殖。cGMP-PKG信号通路对维持血管稳态至关重要，激活cGMP-PKG信号通路可抑制肿瘤细胞血管生成，提示下瘀血汤可能通过该通路调控肝癌血管生成。紧密连接是上皮细胞间的黏连复合物，是肠屏障的重要组成部分，肠屏障的破坏会导致肠道致病菌透过肠屏障，通过肠-肝循环诱发肝癌。此外，通过抑制肿瘤细胞的缺氧、应激、炎症、激酶结合等反应，可抑制肝癌的增殖、侵袭与转移。因此，下瘀血汤可能通过PI3K-Akt信号通路、激素水平、AMPK信号通路调控的脂质代谢、cGMP-PKG信号通路调控的抗血管生长、紧密连接调控的肠屏障，以及缺氧、应激、炎症、激酶结合等多途径发挥抗肝癌作用。

下瘀血汤抗肝癌潜在靶点PPI 网络筛选得到CASP3、ESR1、PPARG、MYC为下瘀血汤抗肝癌的关键潜在靶点。CASP3是肿瘤细胞凋亡的执行蛋白，通过促进CASP3活化可有效促进肝癌细胞的凋亡，抑制肿瘤生长，下瘀血汤中多种成分具有促进细胞凋亡的作用。对于肝癌发病的性别差异，ESR1是一个编码雌激素受体，可抑制肝脏致癌并建立性别特异性基因表，下瘀血汤可能通过ESR1调节激素水平，影响肝癌发病的性别差异。PPARG是过氧化物酶体增殖物激活的受体，PPARG的多态性可能会影响肝细胞癌的易感性，PPAR可通过鞘脂通路调控癌细胞凋亡，下瘀血汤可能通过抑制PPARG受体活化促进凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。MYC是最常见的活化原癌基因之一，可调节细胞的增殖和分化，MYC过表达可诱导侵袭性肝肿瘤，导致转移形成，下瘀血汤可能通过作用于MYC抑制肿瘤的侵袭与转移。分子对接结果显示，下瘀血汤主要活性成分与上述靶点蛋白具有较好的亲和力，其中大黄酚葡萄糖苷和儿茶素二聚体的结合能力最佳，提示下瘀血汤可能通过大黄酚葡萄糖苷和儿茶素二聚体抑制4个靶点，发挥抗肝癌作用。体外细胞实验进一步明确了下瘀血汤对肝癌细胞增殖的抑制作用，以及对4个潜在关键靶点表达的抑制作用。

综上所述，本研究基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术分析鉴定了下瘀血汤的化学成分，结合网络药理学提示山柰酚、儿茶素、苦杏仁苷、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚葡萄糖苷等是其发挥抗肝癌作用的主要活性成分。下瘀血汤抗肝癌的作用机制主要与PI3K-Akt信号通路、炎症反应、激素水平调节、cGMP-PKG信号通路调控的抗血管生成、紧密连接调控的肠屏障、肿瘤细胞的缺氧、应激、激酶结合等途径相关。CASP3、ESR1、PPARG、MYC是下瘀血汤抗肝癌的潜在核心靶点，分子对接显示大黄酚葡萄糖苷、儿茶素二聚体与4个靶点蛋白有较好的亲和活性。最后通过体外细胞实验验证了下瘀血汤抑制肝癌细胞增殖的能力，以及对关键靶点表达的抑制作用。本研究可为进一步阐明下瘀血汤抗肝癌的活性成分及作用机制提供研究方向和数据支持。