脐带源间充质干细胞对肝硬化大鼠的治疗及抗氧化作用

孙慧聪，孙胜珍，祁世杰，洪训宇，韩冠亚

肝移植是治疗终末期肝病的有效方法，但目前由于肝源缺乏、并发症多、多种排异反应及费用昂贵等因素的影响，难以大规模开展[1]，临床期待一种新的可替代方案。间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能，能够分化成软骨、硬骨、脂肪及其他组织类型，具有来源丰富及免疫原性较低的特点。多项临床和亚临床试验显示，MSCs可治疗急性心肌梗死[2]、脑卒中、急性肾损伤[3]、糖尿病[4]、骨折[5]、肺动脉高压[6]及肝病[7]，另有临床试验证明MSCs对严重的移植物抗宿主病有一定作用[8]，但目前MSCs的作用机制仍不明确[9]。人脐带源MSCs（hUC-MSCs）是一种从人类脐带中提取的新型MSCs，目前研究不多，笔者前期研究表明hUC-MSCs 可在体内分化为功能性肝细胞，进而改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的肝功能及病理学变化[10]。本研究以CCl4诱导的大鼠肝硬化模型为研究对象，来探讨hUC-MSCs 移植对肝硬化大鼠的治疗及抗氧化作用，为临床治疗肝硬化提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取健康成年体质量350 ～400 g的清洁级雄性Wistar大鼠36 只，由河北省实验动物中心提供，于河北医科大学第二医院饲养，适应性饲养2 周，温度20 ～25℃，光照明10h/暗14h，自由摄食及饮水。根据《关于善待实验动物的指导性意见》[11]对实验动物进行处理。

1.2 实验材料 美国BECKMAN COULTER 公司生产的CX9 全自动生化分析仪；德国Eppendoff 公司生产的低温高速离心机；梅特勒-托利多公司生产的PL1001-L 电子天平；法国bertin 公司生产的precellys 24 组织均质器；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）检测试剂盒均由上海碧云天生物技术公司生产；分析纯CCl4由上海试剂总厂生产；橄榄油为市售食用橄榄油。天津市和泽干细胞科技有限公司进行hUC-MSCs 的分离、培养及鉴定。

1.3 方法

1.3.1 分离、培养及鉴定hUC-MSCs hUC-MSCs 由天津市和泽干细胞科技有限公司友情提供。用手术剪将新分离脐带剪成小块，用直径1.5 mm 的滤网过滤，并接种于T 75 细胞培养瓶，当细胞融合80%时，用0.125%胰酶消化，1∶3 传代培养。倒置相差显微镜观察hUC-MSCs 形态，显示第3 代hUC-MSCs 呈成纤维细胞形态，并漩涡样生长，生长状态良好。应用流式细胞技术对hUC-MSCs免疫表型进行分析，结果表明分离培养的细胞为hUC-MSCs（封二彩图1）。

1.3.2 模型制作及分组 将大鼠采用随机数字表法分为3 组：（1）正常对照组（n=12）：注射0.9%氯化钠注射液2 ml/kg；（2）模型对照组（CCl4+saline 组，n=12）：CCl4造模成功后，尾静脉注射同等剂量的0.9%氯化钠注射液，并于移植后第8 周处死大鼠。（3）hUC-MSCs 移植组（CCl4+hUC-MSCs 组，n=12）：造模成功后，大鼠尾静脉注射hUC-MSCs 5×106个/只，并于移植后第8 周处死大鼠。按2 ml/kg 剂量，每周2次大鼠四肢轮流皮下注射40% CCl4橄榄油溶液进行造模，造模周期42 d。造模结束后，大鼠禁食不禁水，各组随机抽取2 只，处死大鼠留取肝标本，制成石蜡切片，HE 及MASSON 染色观察肝脏组织形态学变化，并评价模型状态。造模成功后，各组继续皮下注射CCl4，每周2 次直至处死。每日观察大鼠的进食水、毛发及精神状态等。

1.3.3 肝功能测定 留取标本前大鼠放于代谢笼，禁食不禁水，消毒大鼠前胸部皮肤，心尖搏动最强处进针，取大鼠左心室动脉血5ml，静置凝固后离心取上层血清。采用美国BECKMANCOULTERCX9 全自动生化分析仪检测血清中血清谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和清蛋白（ALB）等肝功能指标。

1.3.4 肝脏大体标本观察 消毒后切开腹部皮肤进入腹腔，分离整个肝脏，予0.9%氯化钠注射液冲洗，观察大鼠肝脏标本色泽、质地、体积大小及表面是否光滑等，迅速于液氮中冷冻并保存在-80℃冰箱中待用。

1.3.5 病理指标评价 分离肝脏后取实验大鼠同一部位肝组织，制成肝组织蜡块，切片后予HE 染色及MASSON染色，并于光镜下观察肝脏病理组织学变化。肝脏炎症评分和纤维化分级参照我国病毒性肝炎组织病理学分级分期标准进行，利用计算机图像分析进行胶原纤维定量分析[12]。

1.3.6 抗氧化指标测定 取同一部位肝组织，按1∶9加入冰0.9%氯化钠注射液进行匀浆，3 000 r/min离心10 min，留取上清液，按上海碧云天生物技术公司试剂盒说明书分别测定SOD、GSH、GPx 和MDA等指标水平。

1.4 统计方法 数据采用SPSS 26.0 软件分析，服从正态分布的定量资料采用均数±标准差描述，多组间比较则采用单因素方差分析及SNK-q 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hUC-MSCs移植改善大鼠生活状态 正常对照组大鼠皮毛色泽光泽，进食水正常，活动正常。模型对照组大鼠注射CCl4后，随造模时间的延长，大鼠皮毛色泽逐渐晦暗，精神逐渐萎靡，进食水及活动量明显减少。hUC-MSCs 移植后，随着移植时间的延长，大鼠进食水以及活动量较模型对照组明显增加，但较正常对照组大鼠明显减少。

2.2 hUC-MSCs移植改善大鼠肝脏形态学表现 正常对照组大鼠肝脏颜色暗红，表面细腻光滑。模型对照组大鼠注射CCl4后，肝脏逐渐肿胀，体积开始逐渐增大，后逐渐变小，至CCl4注射第7 周，肝脏体积明显变小，表面明显粗糙不平，显示肝硬化造模成功。hUCMSCs 移植后，与模型对照组大鼠相比，hUC-MSCs 移植可使大鼠肝脏表面相对光滑，色泽相对红润（封三彩图1）。

2.3 hUC-MSCs移植改善肝硬化大鼠肝脏炎性浸润及纤维沉积 大鼠肝硬化造模结束时HE 染色显示肝脏切片组织肝小叶结构紊乱，肝板排列紊乱，肝细胞水肿、汇管区炎性细胞浸润，结合MASSON 染色显示汇管区及中央静脉周围可见大量纤维组织增生，假小叶形成，提示肝硬化模型造模成功。模型对照组与正常对照组大鼠相比，肝小叶结构更加紊乱，肝板排列更加紊乱，肝细胞水肿明显增加、炎性细胞浸润及纤维条索明显增多，而hUC-MSCs 移植组则显示肝细胞坏死、汇管区炎性细胞浸润及纤维沉积有所减少（封三彩图1）。各组肝脏组织的炎症评分以及纤维组织沉积定量分析也显示了同样的结果（图1）。

2.4 hUC-MSCs移植改善肝硬化大鼠肝功能 与正常对照组相比，随造模时间的延长，模型对照组及hUCMSCs移植组ALT、AST、TBIL及DBIL明显升高，ALB则与之相反。hUC-MSCs 移植组大鼠ALT、AST、TBIL及DBIL 较模型对照组明显降低（q≥22.88，均P ＜0.05），ALB则明显升高（q≥9.61，均P＜0.05）。见表1。

表1 hUC-MSCs 移植对肝硬化大鼠各组肝功能的影响

2.5 抗氧化指标变化 与正常对照组大鼠相比，模型对照组及hUC-MSCs 移植组大鼠的肝组织氧化应激指标SOD、GSH及GPx活性的表达水平显著降低，MDA 表达水平显著升高（q≥24.47，均P ＜0.05），而相较于模型对照组而言，hUC-MSCs移植组大鼠肝组织SOD、GSH 及GPx 表达水平显著升高，MDA 表达水平则显著降低（q≥37.27，均P ＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠SOD、MDA、GSH 及GPx 氧化应激指标变化

3 讨论

本研究结果显示，大鼠应用CCl4橄榄油溶液皮下给药42 d后，MASSON染色显示汇管区及中央静脉周围可见大量纤维组织增生，包绕肝细胞形成假小叶，这与同类研究报道一致[13]，表明成功建立大鼠肝硬化模型。大鼠的肝脏病理组织学检查结果表明，hUC-MSCs 移植可明显改善肝细胞坏死，减少肝硬化大鼠的炎症反应及纤维组织形成，这与骨髓源MSCs 移植治疗效果相似[14]。

肝功能是衡量肝脏肝细胞损伤的重要尺度，ALT及AST水平可侧面反映肝细胞损伤程度，ALB作为肝功能的灵敏指标，可协助评估肝损伤程度。有研究显示，将骨髓源MSCs植入CCl4诱导的肝硬化小鼠体内，可使小鼠的肝功能改善，死亡率降低[14]。本研究血清学检测结果显示，hUC-MSCs 移植可使ALT、AST、TBIL 及DBIL 明显下降，ALB 明显升高，与模型对照组差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示hUC-MSCs移植对肝硬化有治疗作用，与上述研究结果一致。

氧化损伤是肝损伤的重要机制，肝脏作为机体重要的代谢器官容易受到自由基攻击。肝细胞是肝脏功能的承担者，肝细胞内线粒体、微粒体以及过氧化物酶体可产生大量自由基，导致肝细胞氧化应激损伤进而最终发生肝脏功能障碍[15]。肝脏细胞的抗氧化防御体系由相关抗氧化酶及细胞因子共同构成，其中SOD 是抗氧化防御体系中最重要的酶[16]，是人体细胞衰老及死亡的最直观指标。GSH 和GPx可分解氢过氧化物，是衡量机体抗氧化能力的重要指标，MDA 是脂质过氧化终产物，可间接反映机体受自由基攻击的严重程度[17]。为证明hUC-MSCs 移植对肝硬化大鼠肝脏的抗氧化作用，本研究进一步检测各组大鼠SOD、GSH、GPx 及MDA 含量。结果发现，与模型对照组相比，hUC-MSCs移植可显著升高大鼠肝脏SOD、GSH 及GPx 水平，降低肝脏组织中MDA 含量（均P ＜0.05），提示hUC-MSCs 移植可缓解CCl4所致肝硬化大鼠肝组织的氧化损伤，抗氧化作用可能是其作用机制。

综上所述，CCl4可成功诱导肝硬化模型，hUCMSCs 移植可能从抗氧化衰老方面改善大鼠的肝硬化程度。在致病因素持续存在的情况下，hUC-MSCs移植只能延缓肝硬化的进程，并不能逆转肝硬化。