微小RNA-146a靶向调控Krüppel样转录因子7对强直性脊柱炎T细胞炎症反应及自噬的影响

李家江，王守鹏，张兆川，赵腾

作者单位：枣庄矿业集团枣庄医院骨科，山东 枣庄 277100

强直性脊柱炎是临床常见的一种炎症性疾病，免疫炎症、细胞自噬等均可能参与强直性脊柱炎发生及发展过程，研究表明细胞炎症因子可参与自身免疫性疾病等多种疾病的发生及发展过程［1-2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种非编码单链RNA 分子，并可通过碱基互补与靶基因结合从而抑制其转录、翻译过程，研究表明miRNA 在强直性脊柱炎病人T细胞中表达异常并可能参与强直性脊柱炎发生及发展过程［3-4］。因而探究miRNA 在强直性脊柱炎病人T细胞炎症反应及自噬中的作用具有重要意义。研究表明强直性脊柱炎病人外周血中微小RNA-146a（microRNA-146a，miR-146a）表达上调，但关于其在强直性脊柱炎发生过程中的作用机制尚未可知［5］。通过生物信息学分析显示Krüppel 样转录因子7（Krüppel-like factor，KLF7）可能是miR-146a 的靶基因，研究表明KLF7 可促进大鼠坐骨神经运动功能恢复，并可在神经损伤修复过程中发挥重要调控作用［6］。因此，本研究主要探究miR-146a对强直性脊柱炎病人T 细胞炎症反应及自噬的影响，探讨其对KLF7的靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 收集枣庄矿业集团枣庄医院收治的强直性脊柱炎病人18 例为研究对象（2016 年2月至2017 年10 月），所有病人均符合强直性脊柱炎诊断标准［7］，其中男10例，女8例，年龄（28.67±6.32）岁。选取同期于枣庄矿业集团枣庄医院体检的健康志愿者24 例为对照组，其中男14 例，女10 例，年龄（30.25±4.12）岁。两组性别（χ2=0.03，P=0.857）、年龄（t=0.98，P=0.333）比较，差异无统计学意义。抽取两组研究对象的外周静脉血10 mL，置于含有EDTA-二钾抗凝试管中，应用人淋巴细胞分离液分离收集外周血单核细胞，采用T 细胞磁珠分离T细胞。

所有病人知情且签署同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；Lipofectamine2000、Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司；PCR 试剂盒购自大连宝生物公司；anti-miR-146a、anti-miR-NC、miR-146a mimics、miR-NC购自广州锐博生物科技有限公司；白细胞介素（IL）-6、IL-17、IL-23 检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗人KLF7 抗体购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗人自噬相关基因5（ATG5）、Beclin-1 抗体购自美国Santa Cruz 公司；HRP 标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 强直性脊柱炎病人T细胞接种于96孔板（5×104个/孔），分别将anti-miR-NC、anti-miR-146a、pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF7 转染至T 细胞，分别记作anti-miR-NC 组、anti-miR-146a 组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-KLF7组。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中miR-146a的表达水平 采用Trizol法提取细胞中的总RNA，参照反转录试剂盒将总RNA合成cDNA，以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，按照实时荧光定量PCR 试剂盒配置反应体系。miR-146a以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-146a 相对表达量。

1.2.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-6、IL-17、IL-23的水平 收集各组细胞培养上清液，采用ELISA 法检测IL-6、IL-17、IL-23 的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 双荧光素酶报告基因检测miR-146a 的靶基因 starBase 预测显示KLF7 的3’UTR 含有miR-146a的互补序列，分别构建野生型载体WT-KLF7与突变型载体MUT-KLF7，分别将WT-KLF7、MUTKLF7 与miR-NC、miR-146a mimics 共转染至T 细胞，检测细胞相对荧光素酶活性。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blotting）检测KLF7、ATG5、Beclin-1 蛋白表达 收集各组强直性脊柱炎病人T 细胞，提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度，SDSPAGE 分离蛋白，转膜，封闭2 h，加入一抗稀释液与孵育二抗稀释液，室温孵育1 h，应用Image J 软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以±s 表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t 检验，计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-146a 在强直性脊柱炎病人T 细胞中的表达 与健康人T 细胞比较，强直性脊柱炎病人T 细胞中miR-146a 的表达量升高［（1.00±0.08 ）比（2.74±0.13），t=53.54，P＜0.001］。

2.2 抑制miR-146a 对强直性脊柱炎病人T 细胞炎症反应的影响 与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-146a 组IL-6、IL-17、IL-23 的水平降低（P＜0.001），见表1。

表1 抑制miR-146a对强直性脊柱炎患者T细胞炎症反应的影响/±s

表1 抑制miR-146a对强直性脊柱炎患者T细胞炎症反应的影响/±s

组别anti-miR-NC anti-miR-146a t值P值重复次数33 miR-146a 0.99±0.07 0.27±0.03 16.38 0.000 IL-6/（ng/L）823.17±14.10 372.31±11.03 43.62 0.000 IL-17/（ng/L）901.00±16.29 428.39±12.34 40.06 0.000 IL-23/（ng/L）886.38±15.11 401.61±11.75 43.87 0.000

2.3 抑制miR-146a 对强直性脊柱炎病人T 细胞自噬的影响 与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-146a 组ATG5、Beclin-1 蛋白水平升高（P＜0.001），见图1，表2。

表2 抑制miR-146a对强直性脊柱炎患者T细胞自噬的影响/±s

表2 抑制miR-146a对强直性脊柱炎患者T细胞自噬的影响/±s

组别anti-miR-NC anti-miR-146a t值P值重复次数33 ATG5 0.33±0.03 0.79±0.07 10.46 0.000 Beclin-1 0.42±0.04 0.91±0.08 9.49 0.001

图1 ATG5、Beclin-1蛋白的表达

2.4 miR-146a 靶向KLF7 starBase 预测显示KLF7 的3’UTR 含有miR-146a 的互补序列，见图2。miR-146a 过表达可降低WT-KLF7 的荧光素酶活性（P＜0.001），而对MUT-KLF7 的荧光素酶活性无明显影响（P=0.775），见表3。与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-146a 组KLF7 蛋白水平升高［（0.89±0.07）比（0.37±0.04），t=11.17，P＜0.001］，见图3。

图2 KLF7的3’UTR含有miR-146a的互补序列

图3 anti-miR-NC组与anti-miR-146a组Krüppel样转录因子7蛋白表达

表3 miR-146a过表达对WT-KLF7及MUT-KLF7荧光素酶活性的影响/±s

表3 miR-146a过表达对WT-KLF7及MUT-KLF7荧光素酶活性的影响/±s

组别miR-NC miR-146a t值P值重复次数33 WT-KLF7 0.98±0.07 0.29±0.03 15.69 0.000 MUT-KLF7 0.97±0.08 0.99±0.08 0.31 0.775

2.5 过表达KLF7 对强直性脊柱炎病人T 细胞炎症反应及自噬的影响 与pcDNA3.1 组比较，pcDNA3.1-KLF7 组IL-6、IL-17、IL-23 的水平降低（P＜0.001），ATG5、Beclin-1 蛋白水平升高（P=0.002），见图4，表4。

图4 pcDNA3.1组与pcDNA3.1-KLF7组KLF7、ATG5、Beclin-1蛋白的表达

表4 过表达KLF7对强直性脊柱炎患者T细胞炎症反应及自噬的影响/±s

表4 过表达KLF7对强直性脊柱炎患者T细胞炎症反应及自噬的影响/±s

组别pcDNA3.1 pcDNA3.1-KLF7 t值P值重复次数33 KLF7 0.38±0.04 1.03±0.08 12.59 0.000 IL-6/（ng/L）823.17±14.10 477.37±12.01 32.34 0.000 IL-17/（ng/L）901.00±16.29 558.67±13.16 28.31 0.000 IL-23/（ng/L）886.38±15.11 531.69±12.75 31.07 0.000 ATG5 0.32±0.03 0.60±0.06 7.23 0.002 Beclin-1 0.44±0.04 0.78±0.07 7.30 0.002

3 讨论

miRNA 可通过调控靶基因表达从而影响强直性脊柱炎病人T 细胞凋亡及自噬等生物学过程，自噬引发的自身免疫耐受可预防自身免疫疾病的发生［8-10］。研究表明降低miR-146a 的表达量可延缓强直性脊柱炎的发展进程［11］。相关报道指出miR-146a 可参与骨髓间充质干细胞成骨分化、血小板免疫炎症反应等多种炎症反应过程［12-13］。本研究结果显示强直性脊柱炎病人T 细胞中miR-146a 的表达量升高，提示miR-146a 在强直性脊柱炎发生及发展过程中可能发挥重要调控作用。

促炎因子与抗炎因子比例失衡是促进强直性脊柱炎发生的重要原因之一，研究表明IL-6、IL-17、IL-23 水平升高可促进炎症反应的发生从而加重疾病进展［14-15］。本研究结果显示抑制miR-146a 表达后，强直性脊柱炎病人T 细胞炎症因子IL-6、IL-17、IL-23 水平降低，提示抑制miR-146a 表达可抑制强直性脊柱炎病人T细胞炎症反应。自噬异常与各种疾病发生及发展有关，ATG5 与Beclin-1 属于自噬的标志物，其表达增强可作为评估自噬水平升高的标志物［16］。本研究结果显示抑制miR-146a 表达后强直性脊柱炎病人T 细胞ATG5、Beclin-1 蛋白水平升高，说明miR-146a 可抑制强直性脊柱炎病人T 细胞自噬水平。提示miR-146a 在强直性脊柱炎病人T细胞自噬过程中发挥重要调控作用。

通过生物信息学软件预测KLF7 可能是miR-146a 的靶基因，本研究证实miR-146a 可靶向结合KLF7。研究表明抑制KLF7 表达可促使视网膜功能、中枢神经功能障碍的发生，还可参与炎症反应的发生过程［17-19］。本研究结果显示KLF7 过表达后，强直性脊柱炎病人T 细胞IL-6、IL-17、IL-23 的水平降低，ATG5、Beclin-1蛋白水平升高，说明KLF7过表达可抑制强直性脊柱炎病人T 细胞炎症反应，并促进细胞自噬的发生。提示miR-146a 可能通过靶向KLF7 基因而参与炎症反应及自噬过程从而在强直性脊柱炎发生过程中发挥调控作用。

综上所述，强直性脊柱炎病人T 细胞中miR-146a 表达上调，抑制miR-146a 表达可能通过上调KLF7 的表达从而抑制强直性脊柱炎病人T 细胞炎症反应，并促进细胞自噬的发生，可为强直性脊柱炎的诊断及治疗提供新方向。