信号传导与转录激活子4信号通路在脂肪酶/Toll样受体4调控M1/M2型巨噬细胞分化的作用及机制

王万虹，史波，张荣林，丁浩，李锦爽，李志龙，叶力硕

作者单位：1南京鼓楼医院集团宿迁医院、徐州医科大学附属宿迁医院，江苏 宿迁 223800；

2宿迁市中医院，江苏 宿迁 223800；

3江西财经大学统计学院，江西 南昌 333000

冠心病仍然是心血管疾病中对人类健康危害最大的疾病，也是心血管疾病中发生猝死最常见的疾病［1-2］。既往文献报道信号传导与转录激活子4（transcriptional activator 4，STAT4）在多种器官组织中表达，尤其在淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞中较高表达［3-5］。STAT4 在Th1/Th2 淋巴细胞分化中作用重大，尤在Th1 中较显著［6］。STAT4可以通过抑制Eoxp3+的调节性T 细胞反应，促进自身免疫疾病的发生［7］。文献报道STAT4基因敲除小鼠除了白细胞介素12（IL-12）反应受损外，还有更多T 辅助淋巴细胞向Th2 分化［8-9］。有研究发现螺旋B表面肽（helix B surface peptide，HBSP）可使肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平降低、M1 型巨噬细胞的数量减少、M1/M2 型巨噬细胞比例降低、抑制内皮细胞凋亡以及促进巨噬细胞向M2型极化，从而抑制AS。HBSP 或可作为干预冠状动脉病变的新靶点；更有研究指出冠心病病人心外膜脂肪组织巨噬细胞浸润较非冠心病病人更明显，表明冠心病的严重程度与M1/M2 型巨噬细胞成正比［10］。本研究自2020 年3—10 月探讨STAT4 信号通路在脂肪酶（LPS）/Toll样受体4（TLR4）调控M1/M2 型巨噬细胞分化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 野生型和STAT4-KO 小鼠共40 只，4～8 周龄，体质量为19～22 g，由南京大学模式动物中心引进。小鼠饲养于南京医科大学实验动物中心SPF 级屏障系统动物房，按照SPF 级饲养条件饲养。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM 培养基（美国，Hy-Clone）、ELISA、Q-RTPCR 试剂盒（Abcam 公司）、HERAcell VISO160i 型二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo 公司）、兔抗小鼠F4/80，iNOS，FTLR4，CD40，CD14，CD11b，Arg-1和CD206多克隆抗体（BD公司，美国）；电泳仪、图像采集和图像分析系统（Bio-Rad，美国）等。

1.3 方法

1.3.1 建立动脉内膜拉伤-增生模型 将野生型和STAT4-KO 小鼠用导丝拉伤颈动脉内膜，建立内皮损伤-修复模型。以超声心动图及病理改变作为建模成功的观察指标。分为野生型和STAT4-KO组。

1.3.2 流式细胞术分析M1/M2 型巨噬细胞在外周血和损伤血管内的变化 取各组小鼠外周血0.5 mL 于流式上样管，按F4/80，iNOS，FTLR4，CD40，CD14，Arg-1 和CD206 抗体说明书，根据抗体组合方案，每管分别加5µL 抗体，避光孵育20 min；71.6×g离心5 min，弃上清，PBS 清洗，54.8×g 离心5 min，收集沉淀加500µL PBS 重悬，300 目筛子过滤，30 min内上机检测，Cell Quest软件进行细胞分类分析。

1.3.3 免疫荧光双染检测M1，M2 型巨噬细胞的表达 14 d 后将大鼠处死，制备肝组织石蜡切片。取两组的大鼠肝组织石蜡切片进行组织免疫荧光染色，CD163 抗体（1∶100）标记M1、M2 型巨噬细胞（红色），6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核（蓝色），分别于波长559 nm 和340 nm 激发光荧光倒置显微镜下观察拍照，Adobe Photoshop 软件合成图片，用Image J 软件计算镜下5 个视野（×200倍）内CD163+标记M1、M2 型巨噬细胞的阳性表达率。

1.3.4 实时荧光定量PCR（q-RT PCR）检测STAT4和TLR4的表达 用q-RT PCR法检测各组STAT4和TLR4 的表达变化，RNA 的提取、逆转录以及q-RT PCR 都按照试剂盒的说明书操作进行。β-actin 作为STAT4 和TLR4 的内参，通过2-ΔΔCt公式分析得到其表达情况。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管生长因子VEGF、PDGF-BB 变化 选取相应处理后的细胞培养上清用于VEGF、PDGF-BB 的ELISA 检测，向相应的样品孔中加入与其对应的样品，37 ℃放置90 min；向每个孔中加入100µL 生物素化的抗体工作液，于37 ℃下放置1 h；每个孔中加100µL酶结合工作液，37 ℃放置30 min ；每个孔中加90 µL 底物溶液（TMB），37 ℃下避光放置15 min 左右；往每个孔中加50 µL 终止液；测量各孔的光密度（OD）值。建立标准曲线，然后进行计算。

1.3.6 巨噬细胞的分化情况 从STAT4KO 和WT小鼠骨髓分离CD11b+细胞，用集落刺激因子GMCSF 和脂肪酶（lipase，LPS）处理，分为WT con 组、WT+LPS 刺激组、STAT4KO con 组、STAT4KO+LPS刺激组。ELISA 法检测M2 型巨噬细胞的诱导因子（IL-4）及M2型巨噬细胞分泌因子（IL-10）的mRNA表达。

1.4 统计学方法 选用SPSS 24.0 软件进行统计分析，数据资料以±s 表示。细胞分类分析采用重复测量数据方差分析，两组均值比较采用t 检验，多组均值比较采用单因素方差分析，定性资料用百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 M1/M2 型巨噬细胞在外周血内的变化 与野生组相比，STAT4-KO 组在术后1、4、7 和14 d 时M1型巨噬细胞F4/80+iNOS+，F4/80+IL-12 的细胞百分比降低（P＜0.05），而M2型巨噬细胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的细胞百分比明显升高（P＜0.05）。且M1型巨噬细胞F4/80+iNOS+及M2 型巨噬细胞F4/80+Arg-1+组别和时间的交互作用对细胞百分比的影响均差异有统计学意义（F=18.62、8.06，P＜0.05）。其中M1型巨噬细胞F4/80+iNOS+在第1、4、7、14天野生组和STAT4-KO 组细胞百分比均差异有统计学意义（F=8.90、77.29、68.29、54.00，P＜0.05），M2 型巨噬细胞F4/80+Arg-1+在第1、4、14 天野生组和STAT4-KO 组细胞百分比均差异有统计学意义（F=522.98、74.99、26.85，P＜0.05）。M1 型巨噬细胞F4/80+F4/80+IL-12 组别和时间对细胞百分比的影响差异有统计学意义（F=36.20、483.66，P＜0.05），其中时间具有主效应，第1、4、7、14天细胞百分比两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。M2 型巨噬细胞F4/80+CD206+组别和时间对细胞百分比的影响差异有统计学意义（F=242.15、139.54，P＜0.05），其中时间具有主效应，第1、4、7、14天细胞百分比两两比较均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2，3。

表2 不同时间外周血M1型巨噬细胞F4/80+iNOS+，F4/80+IL-12的细胞百分比/（%，±s）

表2 不同时间外周血M1型巨噬细胞F4/80+iNOS+，F4/80+IL-12的细胞百分比/（%，±s）

组别野生组STAT4-KO组F值P值重复次数iNOS 1 d 3.60±0.51 2.04±0.85 18.62＜0.001 4 d 11.09±1.04 5.89±1.13 7 d 17.88±1.81 7.39±1.63 14 d 31.49±2.80 18.56±2.20 33 IL-12 1 d 5.55±0.47 4.32±0.51 2.80 0.076 4 d 10.95±1.38 8.77±0.93 7 d 16.33±1.76 13.14±1.37 14 d 22.52±1.84 18.03±1.68

表3 不同时间外周血M2型巨噬细胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的细胞百分比/（%，±s）

表3 不同时间外周血M2型巨噬细胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的细胞百分比/（%，±s）

组别野生组STAT4-KO组F值P值重复次数Arg-1 1 d 7.54±0.77 12.03±0.84 8.06 0.002 4 d 8.47±1.13 13.40±1.00 7 d 10.32±1.39 18.02±1.59 14 d 20.51±2.09 25.00±2.50 33 CD206 1 d 6.80±0.55 10.29±0.76 0.10 0.957 4 d 8.40±0.74 12.25±0.92 7 d 10.80±1.24 14.84±1.40 14 d 14.17±1.58 18.21±1.60

2.2 免疫荧光双染检测M1、M2 型巨噬细胞的表达 STAT4-KO组的M1、M2型巨噬细胞阳性表达率与野生组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 M1、M2型巨噬细胞的阳性表达率比较/（%，±s）

表4 M1、M2型巨噬细胞的阳性表达率比较/（%，±s）

组别野生组STAT4-KO组t值P值重复次数33 M1巨噬细胞11.14±1.49 9.42±0.41 4.98＜0.001 M2巨噬细胞48.73±5.89 89.48±10.43 15.22＜0.001

2.3 STAT4 和TLR4 的表达情况 STAT4 和TLR4在STAT4-KO 组中的表达量明显较野生组低（P＜0.05），见表5。

表5 信号传导与转录激活子4（STAT4）、Toll样受体4（TLR4）的表达情况比较/±s

表5 信号传导与转录激活子4（STAT4）、Toll样受体4（TLR4）的表达情况比较/±s

组别野生组STAT4-KO组t值P值重复次数33 TLR4 0.89±0.08 0.47±0.06 18.46＜0.001 STAT4 1.31±0.07 0.23±0.04 58.00＜0.001

2.4 血管生长因子VEGF、血小板衍生因子PDGFBB 的变化情况 血管生长因子VEGF、血小板衍生因子PDGF-BB在STAT4-KO组中的表达量明显较野生组高（P＜0.05），见表6。

表6 血管生长因子VEGF、PDGF-BB的变化情况/±s

表6 血管生长因子VEGF、PDGF-BB的变化情况/±s

组别野生组STAT4-KO组t值P值重复次数33 VEGF 3.14±0.91 9.28±1.02 20.09＜0.001 PDGF-BB 4.23±0.84 10.56±1.62 15.54＜0.001

2.5 巨噬细胞的分化情况 M2 型巨噬细胞的诱导因子（IL-4）及分泌因子（IL-10）在STAT4KO+LPS刺激组、WT+LPS 刺激组、STAT4KO con 组中的表达量明显较WT con 组高（P＜0.05），其中STAT4KO+LPS刺激组表达量最为显著。见表7。

表7 巨噬细胞的分化情况/±s

表7 巨噬细胞的分化情况/±s

组别WT con组WT+LPS刺激组STAT4KO con组STAT4KO+LPS刺激组F值P值重复次数3333白细胞介素-4 0.49±0.06 1.02±0.21 2.11±0.37 4.02±1.01 80.68＜0.001白细胞介素-10 0.98±0.14 1.22±0.36 2.91±0.42 5.29±1.31 77.04＜0.001

3 讨论

大数据显示，目前心血管疾病死亡率占居民疾病死亡率40%，远高于肿瘤和其他疾病，因此在中国开展心肌保护和心肌再生医学研究是非常有必要的。炎症免疫反应是一种损伤过程，近来免疫系统在血管再生中发挥的作用越来越得到重视。参与固有免疫应答的细胞主要包括巨噬细胞、NK 细胞、NK1.1+T细胞、树突状细胞和B-1细胞等［11-12］。微生物可以通过Toll样受体介导的信号通路在固有免疫应答中引起非T 细胞依赖的IL-12 分泌［13］。巨噬细胞根据其表面标识、属性和功能的不同，可分为经典激活巨噬细胞（Ⅰ型，M1）和替代激活巨噬细胞（Ⅱ型，M2）。研究发现M1 型巨噬细胞通过γ-干扰素和细菌脂多糖（LPS）激活，可释放大量的炎性因子IL-1、IL-6 等，促进炎症反应，促进心肌细胞的损伤和动脉粥样硬化（AS）病变的发展［14-15］；M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13 和免疫复合物激活，表达IL-10等，起着抗炎的作用，促进血管新生、组织修复［16-17］。M1/M2 型巨噬细胞可以参与炎症反应、促进组织修复，并且与一些干细胞或者拥有祖细胞性质的一些细胞产生一定程度的交互作用，可能在组织修复和重构的过程中扮演着重要角色［18］。

本研究中，我们对STAT4信号通路在LPS/TLR4调控M1/M2 型巨噬细胞分化的作用及机制进行研究，发现与野生组对比，在STAT4 基因缺失组中术后1、3、7 和14 天时M1 型巨噬细胞F4/80+iNOS+，F4/80+IL-12 的细胞百分比降低，而M2 型巨噬细胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的细胞百分比明显升高。说明STAT4 信号通路在M1、M2 巨噬细胞的分化过程中起着重要作用。可以提升巨噬细胞Arg-1 的表达水平，抑制iNOS的表达，促进巨噬细胞的M2型极化发展。STAT4-KO 组的M1 巨噬细胞阳性表达率为（9.42±0.41）%，野生组为（11.14±1.49）%，STAT4-KO 组的M2 巨噬细胞阳性表达率为（89.48±10.43）%，野生组为（48.73±5.89）%，即表示抑制STAT 信号通路后，M1 型巨噬细胞得到抑制，而M2型巨噬细胞分化得到明显增强。有研究指出，INF-γ引起的M1 型巨噬细胞极化主要是介导了酪氨酸激酶-信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）的通路，通过激活JAK1 和JAK1 激酶后使转录因子STAT1发生磷酸化，从而引起M1 型标志分子的转录表达，IL-12 通过刺激JAK2 和酪氨酸激酶2 活性，使STAT4 的磷酸化后参与M1 型巨噬细胞的极化［19］。STAT4 和TLR4 在STAT4-KO 组中的表达量明显较野生组低，血管生长因子VEGF、PDGF-BB 在STAT4-KO 组中的表达量明显较野生组高，说明在STAT4 基因的缺失可以明显促进VEGF、PDGF-BB因子的释放。对于细胞实验，结果发现M2 型巨噬细胞的诱导因子（IL-4）及分泌因子（IL-10）在STAT4KO+LPS 刺激组、WT+LPS 刺激组、STAT4KO con 组中的表达量明显较WT con 组高，其中STAT4KO+LPS 刺激组表达量最为显著。即说明STAT4 信号通路也参加巨噬细胞的增殖与分化过程，在STAT4基因的缺失和LPS的刺激下M2型巨噬细胞的分化程度得到明显增强。有研究还发现，STAT4 基因缺失可显著促使巨噬细胞的M2 型极化［20］，这与本研究结果相一致。

综上所述，STAT4信号通路可以抑制M1型巨噬细胞，从而促进增强M2 型巨噬细胞分化，其作用机制可能是通过LPS/TLR4 的结合。本研究可以为心梗病人介入治疗后防止再狭窄和血栓提供新的思路和一定的基础支持。可进一步研究STAT4 信号通路及巨噬细胞变化与内皮细胞和血管新生的关系。