云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG 和inhA 基因突变特征

陈连勇，茹浩浩，杨星，闫双群，陈涛，倪沁璇，许琳

（云南省疾病预防控制中心结核病防治所，云南 昆明 650022）

结核病仍是人类面临的重大公共卫生问题。据WHO 估计[1]，2019 年全球有新发结核病1 000 万，近50 万新发利福平（rifampicin，RFP）耐药肺结核患者，其中78%为耐多药结核病患者（multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB）指同时耐异烟肼和利福平的结核病患者，而中国是全球30 个MDR 高负担国家之一，耐药结核患者占了其中的14%，位居全球第2[1]。耐药结核病尤其是MDR-TB 仍是结核病防治面临的一个严重挑战。异烟肼（isoniazid，INH）自其问世以来一直是治疗结核病的首选药物之一，当结核分枝杆菌对INH 产生耐药时则会严重影响结核病的治疗效果。而耐药从分子水平上大部分是由于结核耐药相关基因位点发生了突变而产生的，同时受地域因素等影响，其耐药基因突变类型和频率存在差异。为了解云南省的INH 耐药结核分枝杆菌基因突变情况，本研究对云南省结核耐药监测点分离的结核分枝杆菌进行INH 耐药相关基因katG 基因和inhA 基因测序，以阐明其耐药基因突变特征，为本地区耐药结核病的快速诊断和防控政策的制定提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

结核分枝杆菌菌株来自于2016 年1 月至12月期间前来云南省32 个耐药监测县就诊的病原学阳性肺结核患者，对其痰标本进行分离培养后获得。结核杆菌标准株（H37RV）由中国疾控中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 表型药物敏感性试验表型药物敏感性试验采用比例法，检测其对6 种抗结核药物的药物敏感性。抗结核药物在培养基中的终浓度分别为：INH 0.2 µg/mL，OFX 2 µg/mL，RFP 40 µg/mL，KM 30 µg/mL，EMB 2 µg/mL 和SM 4 µg/mL。以耐药百分比作为判定标准：<1%者判定为敏感，≥1%则报告为耐药。并以H37RV 作对照进行质量控制。

1.2.2 DNA 模板制备对表型药敏结果显示INH耐药的结核分枝杆菌，从固体罗氏培养基斜面上刮取1 接种环培养3～4 周的新鲜菌株，重悬于200 µLTE 中，恒温金属浴85 ℃孵育30 min 灭活，12000 r/min 离心5 min，然后弃上清，每管分别加入100 µL 去离子水，涡旋振荡重悬；95 ℃恒温金属浴20 min，超声裂解15 min，12000 r/min离心 5 min，取上清液作为DNA 模板备用。

1.2.3 耐药基因扩增及测序从Genebank获得H37Rv 的katG 和inhA 基因序列，采用Primer 5.0 设计引物，对katG 和inhA 基因进行扩增，2对引物的序列分别为：

katG-F：5‘-AATCGATGGGCTTCAAGACG-3’ ；

katG-R：5‘-CTCGTAGCCGTACAGGATCTCG-3’ 。

inhA-F：5‘-CCTCGCTGCCCAGAAAGGGA-3’ ；

inhA-R：5‘-ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT-3’ 。

扩增产物分别为500 bp 和248 bp。每个反应体系为50 µL，包括2×PCR 扩增25 µL、上下游引物（10 mol/L）各1.5 µL，DNA 模板5 µL，去离子水17 µL。PCR 扩增反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 共35 个循环，再72 ℃延伸10 min。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 测序结果比对katG 和inhA 基因测序结果采用BioEdit v7.2.5 软件分析，测序结果与标准菌H37Rv 的基因序列进行比对，确定基因突变位点及基因突变情况。

1.3 统计学处理

建立EpiData 数据库，并将实验结果等信息录入，采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。突变率的比较采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物敏感性实验结果

共收集并分离到846 株结核分枝杆菌，药敏试验结果显示，88 株结核分枝杆菌对INH 耐药，INH 耐药率为10.40%。其中32 株同时对RFP 耐药（即MDR），MDR 率为4.29%，另56 株对INH耐药，而对RFP 敏感（INH 单耐）。

2.2 INH 耐药相关基因突变特征

88 株表型药敏试验结果显示INH 耐药的结核分枝杆菌，对其katG 和inhA 基因进行PCR 扩增，扩增出500 bp 和248 bp 大小的目的基因片段，见图1。

图1 katG 和inhA 基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose GEL electrophoresis of katG and inhA gene amplification products

测序结果显示，73 株检出INH 耐药相关基因突变，15 株（17.05%）未检测到katG 或inhA 基因的突变，INH 耐药基因型与表型的符合率为82.95%（73/88），其中65 株（73.86%）为katG 基因突变，7 株（7.95%）为inhA 基因突变，1 株（1.14%）为katG 基因和inhA 基因的联合突变。基因突变涉及katG 和inhA 的14 个基因突变类型和13 种氨基酸改变，有点突变、双位点联合突变和基因缺失，见表1。

表1 88 株INH 耐药结核分枝杆菌的KatG 和inhA 基因突变情况Tab.1 Distribution of mutations of katG and inhA gene among 88 inh-resistant TB isolates

突变频率最高的位点为KatG315 位点，占INH 耐药菌株数的67.05%（59/88），包括52 株Ser315Thr（碱基改变为AGC→ACC，氨基酸改变为Ser→Thr）基因突变，见图2，6 株Ser315Asn（碱基改变为AGC→AAC，氨基酸改变为Ser→Asn）基因突变，见图2，1 株Ser315Arg（碱基改变为AGC→CGC，氨基酸改变为Ser→Arg）基因突变。有4 株（4.55%）出现katG 基因的双位点突变，见表1，其中1 株出现Ser315Thr+Lys327Lys双位点突变中的Lys327Lys 碱基密码子改变为同义突变，碱基变化为AAA→AAG，而编码氨基酸未发生改变，均为Lys，见表1。7 株（7.95%）INH耐药菌株的基因突变发生于非315 密码子区。

7 株（7.95%）inhA 基因突变位于inhA 基因启动子区域，均为-15 位点（C→T），见图2，占基因突变类型的第2 位。katG315 或inhA-15 位点的突变占到所有INH 耐药菌株数的75%（66/88）。

图2 katG 和inhA 基因的主要突变类型Fig.2 The characteristics of katG and inhA gene mutation

2.3 耐药基因突变与耐药类型的比较

32 株MDR 菌株中有87.50%（28/32）出 现katG 或inhA 基因突变，而56 株INH 单耐菌株中出现基因突变的比例为80.36%（45/56），MDR 和INH 单耐菌株中基因突变比例，差异无统计学意义（χ2=0.735，P=0.391）。32 株MDR 菌株中，katG 基因突变的有28 株，占MDR 数的87.50%，其中出现katGSer315Thr 的比例为62.50%（20/32），见表2，56 株INH 单耐菌株中，katG 基因突变的有38 株（67.86%），其中出现Ser315Thr 的比例为57.14%（32/56），见表2，MDR 菌株中出现katG基因突变的比例与INH 单耐结核分枝杆菌相比，差异有统计学意义（χ2=4.190，P=0.041），而出现katGSer315Thr 基因突变，差异无统计学意义（χ2=0.242，P=0.623）。inhA 基因突变中，7 株inhA-15 位点基因突变均来自于INH 单耐菌株中，1 株inhA-34 位点基因突变来自于MDR 菌株，为与katG314 位点的联合突变，MDR 和INH 单耐菌株的inhA 基因突变，差异无统计学意义（3.13% vs 12.50%，χ2=1.180，P=0.277），inhA-15 位点基因突变，差异无统计学意义（0 vs 12.50%，χ2=2.806，P=0.094）。

表2 不同耐药类型中INH 耐药基因突变情况[n（%）]Tab.2 KatG and inhA gene mutations between MDR and INH mono-resistant [n（%）]

3 讨论

INH 和RFP 作为治疗结核病的2 种最重要的首选抗结核药物，两者均存在价格便宜、杀菌力强和副作用低的特点[2]。由于RFP 耐药的主要分子机制相对简单，96%以上RFP 耐药都是由于apoB 基因的核心区基因突变引起的[3]，表型和基因型耐药高度相关，因而使得RFP 耐药快速检测成为可能，而INH 的耐药机制十分复杂，涉及katG、inhA、ahpC、oxyR-ahpC 等结构基因和调控区[4−7]，其中最为主要的为katG 和inhA 基因。INH 耐药菌株中katG 基因突变率约为60%～95%，而inhA 基因突变率则为8%～43%左右[8−10]。本研究通过对来自云南结核病耐药监测点分离的88株INH 耐药结核分枝杆菌进行katG 和inhA 基因的序列分析，结果显示82.95%的菌株出现INH耐药相关基因katG 和/或inhA 的突变，15 株未检测到katG 基因及inhA 基因的突变，这可能和其它异烟肼耐药相关基因发生突变有关，有关文献报道，在异烟肼耐药菌株中，oxyR-ahpC 突变率可达占5%～10%[2]。本研究中katG 基因突变占INH 耐药菌株数的73.86%，INH 耐药以katG 315位点基因突变为主，超过INH 耐药菌株数的50%，达到67.04%；其次为inhA-15 位点的突变，占耐药菌株数的7.95%，总体结果与国内其它省份基本一致。katG 基因突变率与江西（73.25%）[11]和吉林（70.6%）[12]等地结果接近，高于浙江（63.1%）[13]和北京（62.3%）[14]；katG 315 位点突变率与江西（68.8%）[11]、浙江（63.1%）[13]等地报道接近，低于上海（81.4%）[15]和四川（84.43%）[16]，inhA-15 位点的突变与浙江（10.41%）[13]结果接近，而低于江西（15.30%）[11]、上海（16.9%）[15]、湖南（15.6%）[17]及北京（19.5%）[14]等地结果，提示katG 和inhA 基因突变受地域等因素的影响。目前，商品化的INH 耐药检测分子诊断技术大部分是基于对katG 基因的315 位点和inhA 基因启动子区的几个常见突变位点进行检测，根据本研究，两者占INH 耐药的75%左右，鉴于常规表型药敏检测从痰标本采集到获得药敏结果需分离培养和药敏试验等过程，耗时2～3 个月时间，而分子诊断技术工具大大缩短了诊断的时间，因此合理使用分子诊断技术对于指导临床诊疗具有重要意义，同时今后还需开发或引进包含其它基因或位点的分子诊断工具以提高INH 耐药检测水平。

世界各地结核分枝杆菌中katG 基因中Ser 315Thr 突变的流行率各不相同，与当地结核病疫情密切相关，相比于结核病低疫情地区，高结核病负担地区INH 耐药菌株中的Ser 315Thr 突变率总是处于一个比较高的水平[18]。本研究显示云南省的结核分枝杆菌Ser 315Thr 突变达到INH 耐药菌株数的59.09%，超过50%与国内其他地区的报道基本一致[18]。有研究表明，INH 耐药菌株在katG 315 密码子以外区域的突变频率低于1%[19]，而本研究中315 密码子突变率为7.95%，同时4.55%菌株出现katG 基因双位点突变看，提示我省katG 基因突变的多样性较高。

本研究还对耐多药和INH 单耐菌株的耐药基因突变率进行了分析，结果显示，MDR 结核分枝杆菌中katG 基因突变率显著高于INH 单耐的菌株，这可能与大部分MDR 菌株其INH 耐药性的获得提前于RFP 有关[2]，通常认为katG 突变与结核分枝杆菌对INH 高水平耐药相关，inhA 启动子突变与INH 低水平耐药相关。INH 耐药性尤其是katG 突变更容易诱发菌株对RFP 耐药而形成MDR 菌株。国外相关研究[19−20]也显示MDR 菌株中的katG 基因突变率高于INH 单耐。本研究中虽然MDR 和INH 单耐菌株中其inhA 基因突变比例无显著差异，但7 株inhA -15 位点突变的菌株均来自于INH 单耐，仅有1 株inhA-34+katG314联合突变的菌株为MDR，提示不同耐药类型中，inhA 的基因突变率也可能不同，本研究受限于inhA 基因突变的样本较少，尚不足以明确反映inhA 基因与表型耐药的关系，具体情况还有待于今后进一步研究。

本研究首次通过基因测序手段揭示了云南省结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子特征，并对耐药表型和基因型的关系进行了分析，为云南省今后各类异烟肼耐药检测技术手段在云南省的合理应用提供了技术支撑。