血清缬氨酸、甲硫氨酸浓度水平与乳腺癌临床特征及风险的相关性

解思琦，张恒瑀，李红万，谭明建，王青，李思嘉，郑凯，刘德权，唐诗聪

（云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院乳腺外一科，云南 昆明 650118）

乳腺癌作为世界妇女最常见的恶性肿瘤，其发病率在大部分国家都成逐年增长趋势，据世界卫生组织国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）发布的2020 年全球最新癌症负担数据显示，2020 年全球乳腺癌新发病例高达230 万（11.7%），首次超越肺癌，成为全球最常见癌症[1]。尽管治疗策略有所改进，乳腺癌患者的预后得到了一定改善，但其发病率仍然很高，很大原因是乳腺癌缺乏无创、可靠的早期诊断方法。乳腺癌中氨基酸代谢异常的研究对乳腺癌的诊断及预防具有重要意义，血清氨基酸有望成为乳腺癌早期检测和筛查的生物标志物[2−3]。

氨基酸存在于人体血清中，它对正常细胞和癌细胞的增殖和生存来说都是必不可少的营养物质。健康人群血清氨基酸浓度保持在一定范围内，而肿瘤细胞对促进增殖和癌症进展的营养物质的需求增加[4]。体内氨基酸代谢紊乱不仅会影响全身的糖类、蛋白质等其他代谢，还会影响癌细胞的代谢增殖状态[5]。

近年来，氨基酸与癌症的关系引起了学者们的广泛研究。研究人员在肺癌、直肠癌、前列腺癌等多种癌症患者的体内都观察到了其血清缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）的多种氨基酸水平的显著变化，并且这些氨基酸可能是肿瘤诊断的潜在标志物[6−7]。目前，谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）和甘氨酸（Gly）已被确定为支持癌细胞生长的代谢调节剂[8−9]。实验也表明抑制乳腺癌细胞中亮氨酸（Leu）和谷氨酰胺（Gln）的摄取可以降低细胞活力和延缓细胞周期进展，使得此类氨基酸的阻断剂可通过破坏细胞内氨基酸稳态和抑制代谢和生长途径成为潜在抗癌药物[10]。体外细胞实验已经证实了乳腺癌细胞对支链氨基酸的摄取增加以及癌组织中芳香族氨基酸的过度表达，并且这种差异在乳腺癌细胞和正常细胞间显著存在[11]。

在临床检测中，乳腺癌患者体内氨基酸水平也表现出一定变化。研究显示，与健康对照组相比，乳腺癌患者包括血清缬氨酸（Val）在内的大部分氨基酸浓度显著降低，并且其降低程度与乳腺癌进展呈正相关，但血清Met、苯丙氨酸（Phe）无明显变化。其中丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、Tyr、亮氨酸（Ile）和色氨酸（Trp）被认为是较好的潜在乳腺癌鉴别指标[12]。另有研究指出乳腺癌患者血清Val、Met 浓度水平与健康人群无明显差异，但Gln、Trp、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、Tyr 水平显著降低，而其他氨基酸显著增高[3]。还有研究表明乳腺癌患者术前血清中Val、谷氨酸（Glu）、Gln、Ala 等多种氨基酸的水平明显高于健康对照者，而术后除Val 和Glu 外，其他氨基酸没有这种差异。并且在乳腺癌患者中，侵袭性最强的肿瘤亚型（三阴型）的血清氨基酸水平最高显著高于侵袭性最小的肿瘤亚型（luminal A 型）[13]。

虽然氨基酸与乳腺癌的相关性已经成为学者们广泛研究的热点，但氨基酸与乳腺癌的关系仍有争议，尤其缬Val、Met 在乳腺癌的发生及进展中的作用尚不明确。在该项研究中，笔者测定了乳腺良性肿瘤患者、乳腺癌患者及健康人群的血清Val、Met 的浓度差异，并评估Val、Met 对乳腺癌的诊断价值。另外，还分析了不同乳腺癌亚组分型的Val、Met 的浓度差异，并进一步评估了Val、Met 与乳腺癌风险的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

该研究回顾性分析了2020 年9 月至2020 年12 月期间，就诊于云南省肿瘤医院的乳腺癌和乳腺良性肿瘤患者的病历资料。该研究最终纳入乳腺癌BC 组87 例、乳腺良性肿瘤BE 组38 例，同期纳入志愿检测并提供个人资料的同年龄段的健康女性91 名作为对照组。所有研究对象年龄均为女性，年龄23～76 岁，平均（49±1.04）岁，3 组研究对象的基线特征如性别、年龄、BMI、身高体重数据比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

病例诊断标准[14]：乳腺良性肿瘤组及乳腺癌患者的乳腺超声、乳腺钼靶和乳腺磁共振等影像学检查均在云南省肿瘤医院进行，经云南省肿瘤乳腺外一科医生进行评估后进行组织活检或肿块切除。病理组织标本由云南省肿瘤医院病理科2名以上医师诊断确诊为乳腺良性肿瘤或乳腺癌。且所有乳腺癌患者的病理免疫组化结果和Fish 基因结果都经云南省肿瘤医院病理科医生直接检测得出或经病理会诊得出。

研究对象纳入标准：（1）经病理确诊为乳腺癌或乳腺良性肿瘤；（2）乳腺癌患者的化疗方案都由云南省肿瘤乳腺外一科医生根据患者个体情况拟定，且患者化疗均在云南省肿瘤医院进行。

研究对象排除标准：（1）处于哺乳期；（2）近2 a 内摄入氨基酸药物制剂；（3）合并其他肿瘤；（4）合并心脏病、高血压、糖尿病等重大脏器功能疾病；（5）经确诊后未在昆明医科大学第三附属医院继续治疗及乳腺癌患者未在昆明医科大学第三附属医院行规律化疗；（6）病理及病史资料缺失不满足数据分析。

本研究符合赫尔辛基宣言（2013 年修订），经过昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）伦理委员会批准（编号：KY201944），所有患者均获得知情同意书。

1.2 实验室方法

从2020 年9 月至12 月，所有受试者在空腹状态下于早晨8 点至云南省肿瘤医院乳腺外一科经外周静脉穿刺采血3～5 mL 置于促凝管中，常温保存。其中乳腺癌组中正在接受化学治疗的患者采血时间为第2 个化疗周期化疗药物输注体内后第2 天早晨8 点。采血后，血液标本于2 h 内送至云省肿瘤医院肿瘤研究所，采用液相色谱-串联质谱法进行Val 及Met 检测并出具检测报告，检测试剂盒及仪器均由云省肿瘤医院肿瘤研究所提供。

Val 浓度水平正常参考范围：131～313 µmlo/L，Met 浓度水平正常参考范围：4～44 µmlo/L。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 25.0 软件进行统计学处理，健康对照组、乳腺良性肿瘤组和乳腺癌组的Val、Met 浓度经K-S（Kolmogorov-Smirov）检验及P-P 图检验得出其分布属于非正态分布。统计学方法采用Kruskal-Wallis H 检验分析，浓度水平用中位数及四分位数间距来表示，并评估健康对照组、乳腺良性肿瘤组和乳腺癌组间的血清维生素水平差异的显著性。在根据BC 组和健康对照组的Val 和Met 的浓度水平绘制ROC 曲线，通过ROC 曲线下面积（AUC）评估血清Val、Met 对乳腺癌的诊断效能，并计算其临界值、灵敏度及特异性。计数资料采用χ2检验，分析不同Val、Met 乳腺癌各亚型间差异的显著性。通过二元Logistic 回归分析、计算优势比和95%置信区间（CI）来评估Val 和Met 与乳腺癌的风险关系。

2 结果

2.1 乳腺癌组、乳腺良性肿瘤组和健康对照组的血清Val、Met 浓度的分析

经K-S 检验及绘制P-P 图发现Val、Met 在健康对照组、BE 组和BC 组的浓度水平不完全呈正态分布，采用Kruskal-Wallis H 检验分析3 组间的氨基酸水平差异发现Val（P=0.001）和Met（P<0.001）在健康对照组、BE 组和BC 间的差异具有统计学意义。再经Bonferroni 法校正显著性水平（双侧检验，显著水平为0.05）的事后两两比较发现：Val 在BC 组和健康对照组（P=0.005）、BC 组和BE 组（P=0.013）间的浓度水平差异具有统计学意义，并且BC 组的血清Val 水平高于健康对照组和BE 组，而EB 组和健康对照组间的Val 水平无明显差异。另外，Met 在BC 组和健康对照组（P<0.001）、BE 组和健康对照组（P<0.001）间的浓度水平差异也具有统计学意义，并且BC组和BE 组的Met 水平都高于健康对照组，而BC组和BE 组间的Met 水平，差异无统计学意义（P=0.478），见表1。

表1 不同分组的血清Val、Met 浓度的比较（n=216）Tab.1 Comparison of serum Val and Met concentrations in different groups（n=216）（M±IQR）

2.2 不同亚组乳腺癌患者的临床基线特征

根据BC 组中患者的血清Val、Met 平均数进行分组进行基线特征的亚组分析，其中Val <188.66 µmlo/L 有46 例、Val≥188.66 µmlo/L 有41 例，2 组患者的Val 浓度水平仅在淋巴结是否转移（χ2=7.590，P=0.006）和病理分型（χ2=0.006，P=0.002）上，差异具有统计学意义（P<0.05）；而在年龄、是否停经、初潮年龄、乳腺癌家族史、BIM、TNM 分期、肿块大小、ER、PR、Ki-67、HER-2、AR、是否化疗及是否手术上，差异无统计学意义（P>0.05）。另外血清Met <27.74 µmlo/L 有53 例、Met≥27.74 µmlo/L 有34 例，2 组患者的Met 浓度水平在是否停经（χ2=4.557，P=0.033）、是否化疗（χ2=8.746，P=0.003）和是否手术（χ2=7.130，P=0.008）上，差异有统计学意义（P<0.05），在年龄、初潮年龄、乳腺癌家族史、BIM、TNM 分期、肿块大小、淋巴结是否转移、ER、PR、Ki-67、HER-2、AR 和病理分型上，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 不同Val、Met 浓度水平的乳腺癌患者基线特征Tab.2 Baseline characteristics of breast cancer patients with different concentrations of Val and Met

2.3 TNM 分期、病理分子分型、化疗方案和手术方式对乳腺癌患者血清Val、Met 水平的影响

进行了病理分期的81 例乳腺癌患者、分子分型的80 例乳腺癌患者及接受化疗的61 例患者的氨基酸水平浓度经K-S（Kolmogorov-Smirov）检验及P-P 图检验，大部分符合正态分布，少部分属于轻微偏态。

2.3.1 不同TNM 分期的乳腺癌患者血清Val、Met水平比较对纳入研究的87 例乳腺癌患者进行筛选，排除6 例因病理资料缺失而无法进行分类期的患者，对剩余81 例乳腺癌患者进行TMN 分期，其中Ⅰ期有26 例、Ⅱ期有32 例、Ⅲ期有20 例以及IV 有3 例。对各个分组的乳腺癌患者的血清Val、Met 浓度进行方差齐性检验结果方差都齐，经ANOVA 检验发现不同分期的乳腺癌患者Val、Met 浓度，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 不同分期乳腺癌患者的Val、Met 浓度水平比较（n=81）Tab.3 Comparison of levels of Val and Met in breast cancer patients in different stages（n=81）

2.3.2 不同病理分子分型的乳腺癌患者血清Val、Met 水平比较在排除7 例因病理数据缺失而无法进行分类的患者后，对80 例乳腺癌患者进行分子分型，其中Luminal A 型有15 例、Luminal B型有34 例、三阴型有10 例、HER-2 阳性（HR 阳性）有10 例以及HER-2 阳性（HR 阴性）11 例。通过方差齐性检验，Val 浓度的方差不齐（P<0.05），采用Welch 检验得出结果，Val 在不同分子分型组间的差异具有统计学意义（F=3.403，P=0.023），经塔姆黑尼Tamhane T2 检验进行事后多重比较，仅Luminal B 型组和HER-2 阳性（HR 阴性）组间的Val 浓度，差异具有统计学意义（P=0.026），其余分组间的Val 浓度差异无统计学意义（P>0.05）。Luminal B 型组的Val 平均浓度为（191.81±37.75）µmlo/L，HER-2 阳性（HR 阴性）的Val 平均浓度为（153.69±30.13）µmlo/L，Luminal B 型组的Val比HER-2 阳性（HR 阴性）组平均高出（38.121±11.16）µmlo/L。另外，Met 浓度的方差齐，经ANOVA检验发现不同分子分型组间的Met 浓度，差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 不同分子分型的乳腺癌患者Val、Met 浓度水平比较（n=80）Tab.4 Comparison of Val and Met concentrations in breast cancer patients with different molecular types（n=80）

2.3.3 不同化疗方案的乳腺癌患者血清Val、Met水平的影响在纳入乳腺癌研究组的87 例患者中，有61 名患者进行了化疗。根据化疗方案的不同，将该61 例病例分为4 组：TC 方案组有11 例、AC 方案有22 例、EC/AC-T 方案有22 例以及其他方案6 例方差齐性检验，化疗患者血清Val、Met 浓度水平方差都都齐（P>0.05），经ANOVA检验，不同化疗方案组的Val、Met 浓度，差异无统计学意义（P>0.05），见表5。

表5 不同化疗方案乳腺癌患者的Val、Met 浓度水平比较（n=61）Tab.5 Comparison of levels of Val and Met in breast cancer patients with different chemotherapy regimens（n=61）

2.4 血清Val、Met 浓度水平与乳腺癌风险关系

采用二元Logistic 回归分析血清Val、Met 浓度水平与乳腺癌的风险关系，

对乳腺癌组及健康对照组的血清Val、Met 浓度进行Hosmer-Lemeshow 霍斯默-莱梅肖拟合优度检验（HL 检验），其显著性为0.081（P>0.05），数据与回归模型拟合程度较好。回归分析结果：血清Val 浓度水平和乳腺癌风险无明显关系，但血清Met 会显著影响乳腺癌的发生（P<0.001），血清Met 的浓度越高，乳腺癌的患病风险就越高，并且Met 的浓度水平每增加一个单位，乳腺癌患病风险就增加24%（OR=1.24 95%CI：1.15-1.34），见图1。

图1 血清Val、Met 与乳腺癌的风险关系Fig.1 The relationship between serum Val，Met and breast cancer risk

2.5 血清Val、Met 水平对乳腺癌的诊断意义

经二元Logistic 回归分析，血清Val 水平对乳腺癌患病无显著影响，而血清Met 会对乳腺癌患病产生影响。图2 根据BC 组和健康对照组Met的浓度水平绘制ROC 曲线，差异有统计学意义（P<0.05）。结果如表6 所示，血清Met（P<0.001）都乳腺癌的诊断，差异有统计学意义（P<0.05）。其AUC 为0.83、敏感度及特异性分别为69%和90.1%，临界值为19.76 µmlo/L。

表6 乳腺癌组和健康对照组血清Met 的ROC 曲线下面积（AUC）、敏感度（%）和特异性（%）及 95% CI 参数Tab.6 Area under the ROC curve（AUC），sensitivity（%），specificity（%）and 95% CI parameters of serum Met in breast cancer group and healthy control group

图2 乳腺癌组和健康对照组的血清Val、Met ROC 曲线Fig.2 Serum Val and Met ROC curves of breast cancer group and healthy control group

3 讨论

血清氨基酸在乳腺癌诊断与预防中的潜在意义已经成为了医学研究的热点，也有大量研究提示了血清氨基酸在乳腺癌中的生物标记作用及风险关系。但目前的研究结论并不一致，氨基酸与乳腺的关系仍有争议，并且在中国进行的氨基酸与乳腺癌相关研究较少，尤其是Val、Met 在乳腺癌中的有关研究缺乏。

氨基酸作为蛋白质的基本单位，同时也是多种生物合成途径的中间代谢物，在人体的新陈代谢中发挥着重要的作用，而氨基酸在体内的代谢改变会对肿瘤细胞及肿瘤免疫微环境产生影响，所以肿瘤患者体内的氨基酸水平可能有所变化。Tyler Barnes 等[15−16]的研究纳入了8 名乳腺癌患者及年龄、BMI 与其相匹配的健康女性，还有8名健康的年轻女性，通过高效液相色谱法测定了她们的血清氨基酸水平并比较其差异，结果发现与健康对组相比，乳腺癌患者的血清Val、Met 的浓度分别为（213±58）µmol/L、（27±10）µmol/L，与健康对照组的血清Val、Met 浓度的差异无统计学意义（P>0.05）。

但在笔者的研究中发现乳腺癌患者与健康对照组的血清Val、Met 差异具有统计学意义，并且与健康对照组相比，乳腺癌患者的Val、Met 浓度升高。并且乳腺癌患者的血清也是高于乳腺良性肿瘤组，所以造成这种差异的原因有可能是乳腺癌患者体内的氨基酸代谢发生改变，从而导致血清Val、Met 的浓度水平增高。在笔者的研究中，通过检测健康人群、乳腺良性肿瘤患者及乳腺癌患者的血清Val、Met 浓度，比较Val 及Met 在不同人群中的差异，并进一步分析了血清Val、Met与在乳腺癌各亚型中的浓度，同时探究了血清Val、Met 对乳腺癌的诊断作用及风险影响。Val作为支链氨基酸可以通过线粒体支链α 酮酸脱氢酶复合体参与代谢而产生琥珀酰辅酶A 和乙酰辅酶A，并通过三羧酸循环进行氧化而产生能量，并且参与了脂肪酸的合成为机体提供能量来源[16]。而肿瘤细胞在体内的生长和增需要消耗更多的能量，乳腺癌患者血清Val 浓度的增加就可能与癌细胞能量需求的增加有关。Thandapani P 等[17]将人类淋巴细胞白血病的肿瘤细胞移植到小鼠体内进行了饮食观察，发现Val 会激活肿瘤的生长，也就意味着肿瘤细胞的生长很可能依赖缬氨酸。同样，Val 的摄入也和乳腺癌的生长有关，Kou，Fang 等[11]对来自 HCC 1806（乳腺癌细胞）和 MCF-10A（正常乳腺上皮细胞）细胞系的细胞培养基样品进行了 40 种氨基酸和衍生物的靶向代谢组学分析后观察到乳腺癌细胞对Val 的摄取摄取显着增加。Val 与肿瘤细胞增殖的相关性得到了越来越多的认可，未来也需要有关的实验来证明该结论的可靠性。

由于肿瘤细胞对氨基酸的消耗增加，为此有研究提出或许可以通过靶向氨基酸的代谢消耗氨基酸来诱导肿瘤细胞的凋亡。因为肿瘤细胞的生长增殖主要依赖于外源性氨基酸的供应，而相对于肿瘤细胞，正常细胞对氨基酸的代谢需求较低，当肿瘤细胞选择性地依赖于外源性特定氨基酸的供应时，干扰肿瘤细胞获得氨基酸，将导致肿瘤细胞氨基酸饥饿、生长停止并逐渐发生凋亡[18]。在氨基酸中，Met 不仅是人体的必须氨基酸，同时也是体内最重要的甲基供体，影响着生物的合成与代谢。Jeon，Hyein 等[19]研究了氨基酸对人三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系 MDA-MB-231 和Hs 578T 以及原位 4T1 小鼠 TNBC 肿瘤模型的转移表型的特异性抑制作用后提出，与对照组相比，缺乏Met 饮食的饮食的小鼠乳腺癌肺转移率较低。这也提示了限制Met 的摄入可以为更有效的癌症治疗提供潜在的营养策略。但由于目前相关研究仅在动物实验进行，靶向氨基酸代谢在乳腺癌的临床治疗价值还需进一步的研究来验证，并提供更多数据来证明该方法的可行性。

考虑到Val、Met 浓度水平在乳腺癌患者的体内有所增高，笔者进一步探究了Val、Met 在乳腺癌中的诊断意义。结果提示血清Val、Met 对乳腺癌的诊断都具有统计学意义，提示了Val、Met 可能成为乳腺癌的生物标志物，其中Val 临界值为165.34 µmlo/L，Met 的临界值为19.76 µmlo/L。另外，Cheng，Fei 等[20]采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）测定了27 名乳腺癌患者及28 名健康女性的唾液唾液游离氨基酸，并用ROC 曲线评估了每种氨基酸的诊断性能，结果表明包括Val、Met 在内的15 中氨基酸都有作为乳腺癌早期诊断生物标志物的潜能，其中Val 的灵敏度为70.6%、特异性为71.4%，临界值为280.1 ng/mL；Met 的灵敏度为82.4%、特异性为71.4%，临界值为6.8 ng/mL。虽然该项研究与笔者研究的测定样本不一样，但其结果都提示了体内Val、Met 在乳腺癌中具有诊断意义，其作为生物标记物在乳腺癌诊断中的临床价值值得重视。

虽然乳腺癌的确切病因尚不清楚，但其发生与年龄、初潮年龄、绝经状态、绝经前口服避孕药的使用、绝经后激素的使用、产次、肥胖、饮酒和乳腺癌家族史密切相关[21]。在笔者的研究中，对乳腺癌不同基线特征患者的血清Val 和Met 浓度进行了分析后发现淋巴结是否转移和不同病理分型的患者中的血清Val 浓度有所不同，并且患者的停经状态、化疗及手术也会影响患者体内的Met 浓度。导致这种差异的原因可能由于机体状态的改变影响了氨基酸的吸收与代谢，因为人体获取氨基酸不仅可以通过肠道吸收，还可以由微生物代谢产生[22]。年龄的增加、手术对机体状态的改变以及化疗引起的胃肠道副反应都有可能影响肠道对氨基酸的吸收，同时也可能影响肠道微生物的稳态，从而影响血清中的氨基酸水平。另一方面，氨基酸在体内的分解代谢主要在肝脏中通过丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶等多种酶的作用下进行，同时氨的解毒过程也在肝脏中进行[23]。而化疗药物对肝脏产生的毒性作用也可能在一定程度上影响了氨基酸在体内的代谢过程。

目前较多的研究都提示了血清氨基酸与乳腺癌潜在的相关性。Nagata，Chisato 等[24]通过液相色谱-质谱法人对了350 例有规律的月经且月经周期少于 40 d 的日本女性空腹血浆的20 种氨基酸进行了定量测定，分析后发现研究对象的BMI 与体内Ala、Val、Iso、Leu、Tyr 浓度呈正相关，并且提出血浆氨基酸有可能与日本绝经前女性乳腺癌风险相关。同样，笔者也进一步探究了血清氨基酸与乳腺癌的风险关系，发现血清Val 浓度水平和乳腺癌风险区无显著相关，有相同结论的是Tobias，Deirdre K 等[25]在对护士健康研究和护士健康研究 II 纵向队列的196 161 名女性支链氨基酸摄入量与乳腺癌的风险关系的相关研究中，并没有发现包括Val 在内的支链氨基酸摄入量与乳腺癌风险之间的关联。但笔者的研究结果也表明血清Met 与乳腺癌的风险相关，血清Met 的浓度越高，乳腺癌的患病风险就越高，并且Met 的浓度水平每增加一个单位，乳腺癌患病风险就增加24%。这也提示有可能通过干预体内的Met 浓度水平从而降低乳腺癌的风险，但其可行性及有效性还有需要更多的研究来进一步证实。

综上所述，血清Val、Met 在不同人群中的表达是存在差异，血清Met 浓度与乳腺癌的风险呈负相并对乳腺癌的也具有一定的诊断价值，有望成为乳腺癌诊断中新的生物标记物并且通过控制其摄入量及靶向氨基酸代谢也可能成为乳腺癌的潜在预防及治疗策略。但以上推论仅基于该研究结果及目前相关研究，其在乳腺癌临床用中的价值还需进一步的研究来验证，并提供更多数据来证明该方法的可行性。