抑制P2X7受体表达对高糖诱导的肾间质成纤维细胞TGF-β1/p38MAPK信号通路的影响

张和平 谢荣 刘佳丽 李沁云 杨琨 冯江超

(川北医学院附属医院肾内科，四川 南充 637000)

高血糖是引发糖尿病微血管并发症的主要原因，而肾脏是糖尿病血管并发症中常累及的器官，多数研究表明，糖尿病的发生，会使机体长期处于高血糖状态，不仅经多种方式损伤肾小球，还会损伤肾小管间质，最终影响肾功能〔1〕。肾间质成纤维细胞是肾间质的主要构建细胞，与肾小管肾血管相互连接，当其被活化后其细胞膜表面会出现较多活性物质，产生多种作用，调节细胞增殖、分化〔2〕。P2X7受体(R)是三磷酸腺苷(ATP)门控阳离子通道受体，属于嘌呤受体P2X家族受体亚型之一，P2X7R由595个氨基酸残基组成，由羟基端、氨基端、胞内域、保守胞外环的两次扩膜蛋白所组成，在正常生理条件下，P2X7R在生长肾脏中极低表达，但在肾脏处于病理状态下时，P2X7R表现为显著升高现象〔3〕。近年来随着临床上对糖尿病肾病的深入研究发现，转化生长因子(TGF)-β1/p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路形成正负反馈机制参与此病的发展〔4～6〕。本文探讨抑制P2X7R表达对高糖诱导的肾间质成纤维细胞TGF-β1/p38MAPK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1材料 肾间质成纤维细胞源于川北医学院附属医院病理科正常端肾脏组织。本研究获得医院伦理委员会批准。主要试剂：P2X7R序列设计、合成及慢病毒悬液制备(上海吉玛制药技术有限公司)；小鼠抗大鼠TGF-β1抗体(上海一基实业有限公司)；兔抗人p38MAPK抗体(武汉博欧特生物科技有限公司)；兔抗大鼠Caspase-3抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司)。

1.2P2X7R序列设计、合成及慢病毒悬液制备 根据siRNA设计原则，使用基因序列数据库GenBank查找序列病获得P2X7R基因序列，使用Ambion公司的在线设计软件在P2X7R的序列中获取特异序列作为干扰靶序列，之后利用基于局部比对算法的搜索工具(BLAST)分析设计序列的特异性，确定siRNA干扰靶序列及无同源性的阴性对照序列(siNC)，siRNA干扰靶序列及无同源性的阴性对照序列、慢病毒悬液均由上海吉玛制药技术有限公司合成。siRNA干扰靶序列：5′-GCCACAACTATACCACHAGAA-3′；siNC序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；慢病毒悬液规格均为1.0×10e11pfu/ml。

1.3肾间质成纤维细胞分离、鉴定 取川北医学院附属医院病理科行肾肿瘤切除的正常端肾脏组织，将肾盂组织、肾白膜去除后分离髓质、皮质，将肾髓质组织制备为1 mm3大小的组织块，使用0.1%胶原酶溶液在温度为37℃下消化后，过70、150目筛网，采用DMEM-F12培养液(内含10%胎牛血清)收集细胞悬液，之后做肾间质成纤维细胞鉴定，使用倒置相差显微镜观察所收集的细胞，细胞呈现为梭形，采用免疫组化方法鉴定，细胞抗波形蛋白单抗为阳性、抗细胞角蛋白、抗desmin单抗为阴性即为人肾间质成纤维细胞。

1.4高糖诱导肾间质成纤维细胞 培养肾间质成纤维细胞，取对数生长期的培第3代细胞做细胞消化处理〔胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)〕，以1×104/ml的密度将细胞接种于96孔培养板中，当细胞处于亚融合状态时使用无血清培养液孵育1 d，当细胞处于相对静止期后做分组处理。将细胞分为空白组、高糖组、过表达组、沉默组，其中空白组细胞使用DMEM完全培养液+5.5 mmol/L葡萄糖培养；高糖组使用DMEM完全培养液+25 mmol/L葡萄糖培养；过表达组细胞使用2 ml按照1∶1比例所混合的siNC P2X7R慢病毒悬液和DMEM培养液+25 mmol/L葡萄糖培养；沉默组细胞使用2 ml按照1∶1比例所混合的siRNA P2X7R慢病毒悬液和DMEM培养液+25 mmol/L葡萄糖培养。

1.5细胞增殖能力检测 采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况，使用含有10% 胎牛血清培养液配单个细胞悬液，细胞按7×103个/孔接种于96孔板，每孔体积200 μl，培养2～4 d后，每孔加入MTT继续孵育4 h后停止。孔内培养清液直接吸弃，悬浮细胞上的培养清液需离心后再吸弃，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡12 min，选择570 nm波长，采用酶联免疫吸附试验检测仪测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线。最后根据细胞增殖率计算公式，细胞增殖率=(细胞组OD值/参照值-1)×100%，对各组细胞增殖率进行计算。

1.6细胞凋亡能力检测 使用DxFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)检测各组细胞凋亡情况，将细胞传代至5孔板中，在37℃、5%CO2环境下培养24 h、48 h、72 h后，加入0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min离心处理5 min，收集离心处理后的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤2次，每次洗涤3 min，再次离心收集细胞，加入1 ml碘化丙啶(PI)染液，在避光常温下放置1 h，使用特异荧光标记，标记后在鞘液包裹下高速流动，流动期间发射光子，利用发光信号测量仪检测光子数值，使用流式细胞仪检测。

1.7各组细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量检测 采用硫代巴比妥酸比色法检测各组细胞MDA含量，采用均相竞争抑制原理放免法检测各组细胞SOD含量。

1.8各组细胞TGF-β1/p38MAPK信号通路因子表达量检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法测定各组细胞中TGF-β1/p38MAPK信号通路因子表达量，使用Trizol法提取细胞总RNA，以2 μg RNA作为初始模板，配制20 μl的总反应体系，应用Gene Amp PCR System 9700核酸扩增仪做cDNA反转录，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，之后4℃保持，以所合成的cDNA为模板，以β-actin作为内参，配制20 μl反应体系，使用美国ABI 7300实时荧光定量PCR系统做扩增荧光定量，PCR条件：95℃预变性60 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行40个循环。采用2-△△Ct方法计算TGF-β1/p38MAPK信号通路因子TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表达量。引物序列：TGF-β1上游：5′-ATTCCTGGC GTTACCTTGG-3′，下游：5′-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3′；p38MAPK：上游：5′-CAGCCCACGGACCAAATA-3′，下游：5′-AACGAGCATCTTCTCCAGTA-3′；β-actin：上游：5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游：5′-CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC-3′。

1.9统计学处理 采用SPSS20.0软件进行方差齐性检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组细胞增殖及凋亡情况比较 高糖组、过表达组、沉默组细胞增殖率及凋亡率明显高于空白组(P<0.05)；过表达组细胞增殖率明显高于高糖组，凋亡率明显低于高糖组(P<0.05)；沉默组细胞增殖率明显低于高糖组，凋亡率明显高于高糖组(P<0.05)；沉默组细胞增殖率明显低于过表达组，凋亡率明显高于过表达组(P<0.05)。见表1、图1。

2.2各组细胞MDA、SOD水平比较 高糖组、过表达组、沉默组MDA水平明显高于空白组，SOD水平明显低于空白组(P<0.05)；过表达组MDA水平明显高于高糖组，SOD水平明显低于高糖组(P<0.05)；沉默组MDA水平明显低于高糖组，SOD水平明显高于高糖组(P<0.05)；沉默组MDA水平明显低于过表达组，SOD水平明显高于过表达组(P<0.05)。见表2。

2.3各组细胞TGF-β1/p38MAPK信号通路因子表达量比较 高糖组、过表达组、沉默组TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表达量均明显高于空白组(P<0.05)；过表达组TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表达量均明显高于高糖组(P<0.05)；沉默组TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表达量均明显低于高糖组(P<0.05)；沉默组TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表达量均明显低于过表达组(P<0.05)。见表2。

表1 各组细胞增殖和凋亡情况比较

图1 72 h时各组细胞凋亡流式细胞图

表2 各组细胞MDA、SOD水平及TGF-β1/p38MAPK信号通路因子表达量比较

3 讨 论

糖尿病肾病是导致终末期肾衰竭的主要原因之一，其病变早期主要表现为高血糖所致的肾脏肥大、肾脏血流动力学紊乱、氧化应激等，随着病程的增加可引发肾小球硬化、肾间质纤维化，当上述病变发生后往往不可逆转，导致此病的治疗较为棘手，严重威胁着患者的生命安全〔7〕。因此寻找早期诊治糖尿病肾病的靶点，对患者预后具有重要的意义。

P2X7R广泛分布于脑、肾、肺、肝、肌肉、脾等多种组织中，主要在单核细胞、巨噬细胞上表达〔8,9〕。研究发现〔10〕，P2X7R参与多种肾脏疾病的发生发展，包括高血糖所致的肾功能损伤、肾毒性、肾血管梗阻所致的肾功能损伤、高血压所致的肾损伤等。临床研究发现〔11～13〕，糖尿病肾病发生后，P2X7R表达显著升高，参与高血糖所致的肾功能损伤过程。基于前期研究，本文结果提示，抑制P2X7R表达可能经抑制高血糖所诱导的肾间质成纤维细胞活化，抑制增殖，促进凋亡，进而减轻肾损伤。

TGF-β1具有较为广泛的生物学作用，可促进机体微环境中的胞外基质纤维生成、诱导局部血管增生，参与糖尿病肾病的发生发展过程，TGF-β1在促进胞外基质纤维生成与多信号转导通路相关，其中MAPK通路为较为重要的一条通路，在机体处于高糖状态时，此通路被激活，可将细胞外刺激信号传递至细胞核，与细胞损伤应激、再生相关，可在一定程度上促进糖尿病肾病进展〔14～16〕。p38MAPK属于MAPK通路成员之一，在被胞外刺激后，会被磷酸化，其磷酸化后会移位至细胞核，参与细胞生物学行为过程，调节TGF-β1表达〔17〕。临床研究发现〔18,19〕，高糖可激活p38MAPK信号转导通路，促进TGF-β1表达，而TGF-β1可增强p38MAPK活性，两者相互作用参与肾小管间质、肾小球损伤。另外有研究显示〔20～22〕，TGF-β1/p38MAPK信号可引起机体氧化应激，而氧化应激的发生可增加氧自由基，表现为MDA含量升高，SOD含量降低。本文结果提示，P2X7R表达可能经作用于TGF-β1/p38MAPK信号通路来抑制高血糖所诱导的肾间质成纤维细胞活化，抑制氧化应激，抑制增殖，促进凋亡，进而减轻肾损伤。

综上，抑制P2X7受体表达可经影响高糖诱导的肾间质成纤维细胞TGF-β1/p38MAPK信号通路，抑制氧化应激，抑制增殖，促进凋亡，进而减轻肾损伤，但目前临床上并未有研究认为两者作用与高糖诱导的肾间质成纤维细胞相关，且本文并未深入研究其具体作用机制，还需后续试验进一步加以证实。